Whole-genome CRISPR/Cas9-vermittelte Identifizierung vom miR-200 Repressoren

• Antragsteller: Dr. Paolo Ceppi
• Fachliche Zuordnung: Hämatologie, Onkologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 391926110

Seit ihrer Entdeckung stellen microRNAs (miRNAs) ein wichtiges Forschungsgebiet in fast allen Bereichen der Biologie und Medizin dar und haben zur Aufklärung vieler bedeutender Signalwege und biologischer Mechanismen beigetragen. In der Tumorforschung sind miRNAs funktionell assoziiert mit vielen tödlichen Merkmalen von Krebserkrankungen: Chemoresistenz, veränderter Metabolismus, Metastasierung, dem Prozess der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) sowie den Stammzelleigenschaften von Krebszellen. Da keine geeigneten Werkzeuge existieren, um miRNA Regulatoren in einer unvoreingenommenen Weise auf Ebene des gesamten Genoms zu erforschen, sind bisherige Untersuchungen meist auf Signalwege beschränkt, welche miRNAs nachgeschaltet sind (downstream). Das Hauptziel dieses Forschungsantrages ist die Optimierung und der Einsatz einer neuartigen Hochdurchsatz-Methode, um vorgeschaltete (upstream) miRNA Regulatoren zu identifizieren. Hierfür soll ein kürzlich von uns entwickeltes Sensorsystem verwendet werden, welches auf einem Plasmid mit fluoreszierenden Eigenschaften beruht und die Expression von miRNAs in lebenden Zellen messen und kontrollieren kann. Die Screening werden in Kombination des miRNA Reportersystems mit der CRISPR/Cas9 whole-genome editing Technologie, FACS Sorting sowie Hochdurchsatzsequenzierung durchgeführt. Gegenstand der Untersuchungen ist die miR-200 Familie, deren Mitglieder als starke Repressoren von EMT und Krebsstammzelleigenschaften charakterisiert sind. Das Projekt ist in zwei Teile gegliedert: 1) Ich werde Hochdurchsatz-Screenings durchführen und die dabei identifizierten miR200-Repressor-Kandidatengene in unabhängigen Experimenten validieren. 2) Ich werde die Bedeutung der miR-200-Repressoren für den EMT Prozess anhand relevanter in vitro Zellkultur-Modelle sowie in klinisch annotierten Proben von Krebspatienten ermitteln. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse haben eine potentiell hohe Bedeutung für das Gebiet der molekularen Onkologie, da die identifizierten Signalwege durch spezifische Inhibitoren angegriffen und zur Behandlung solider Tumore als anti-EMT (anti-metastatischer) Wirkstoff getestet werden könnten. Dieses Projekt könnte außerdem einen noch nie dagewesenen Grundsatzbeweis erbringen, der den miRNA Sensor als neues Werkzeug zur unvoreingenommenen Identifizierung von upstream Regulatoren von miRNAs präsentiert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen