Die Rolle von HDAC3 im Notch Signalweg

• Antragsteller: Professor Dr. Tilman Borggrefe
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie ; Entwicklungsbiologie ; Hämatologie, Onkologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 393040308

Der Notch Signalweg spielt eine zentrale Rolle in der Regulation zellulärer Prozesse wie Proliferation, Stammzellerhalt und Differenzierung sowie in der Krebsentstehung. Posttranlationale Modifikationen (PTMs) der Notch-intrazellulären Domäne (NICD) regulieren die Stärke und Dauer der Notch-Antwort; die PTMs kontrollieren nicht nur die Halbwertszeit des NICD-Proteins sondern auch den transkriptionelle Output. In unseren vorläufigen Ergebnissen konnten wir zeigen, dass Verlust von HDAC3 zur Repression von Notch-Zielgenen führt und dass die NICD-Protein-Stabilität betroffen ist. Diese vorläufigen Ergebnisse sind überraschend, weil HDACs generell als Korepressoren bekannt sind.Ziel-1 (aim-1) ist es die HDAC3-regulierten Lysine des NICD-Proteins durch einen etablierten Acetylierung/Deacetylierungs-Assay verbunden mit anschliessender massenspektroskopischer Analyse zu identifizieren. Parallel dazu wollen wir NICD KR Mutanten und spezifische anti-Azetyl-NICD Antikörper herstellen. Mit Hilfe dieser Werkzeuge wollen wir in Ziel-2 (aim-2) den molekularen Mechanismus in Bezug auf PTMs aufklären. Es ist bereits bekannt, dass die NICD C-terminalen PEST-Domäne phosphoryliert und poly-ubiquitiniert wird, wohingegen die N-terminalen Hälfte der NICD azetyliert wird. Nun wollen wir aufklären, ob Azetylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung voneinander abhängig sind und ob NICD-Azetylierung eine Voraussetzung für Ubiquitinierung ist. Unsere Arbeitshypothese hierbei ist, dass NICD-Azetylierung einen starke aber kurze Notch-Antwort benötigt wird. Die Bindung über Acetyl-NICD als Platform für Ubiquitin E3 Ligase Fbw7 würde dann Transkription von Notch-Zielgenen stimulieren, aber zugleich auch zum raschen Abbau der NICD-Koaktivators führen. In Hinblick auf Ziel-3 (aim-3) wollen wir die Spezifität und Funktion der HDAC3 im Notch-Signalweg weiter charakterisieren. Alle anderen Klasse-I HDACs werden mittels unseren NICD-Acetylierungs-Assays getestet. Ebenfalls werden wir HDAC1, -2 und -8 Knockdown Zellen generieren und mit anschliessender RT-qPCR die Expression von Notch Zielgenen überprüfen. Da HDAC3 als Histon-Deacetylase beschrieben wurde, werden wir auch den Histon-Acetylierung-Status an Notch Zielgenen mittels Chromatin-IP analysieren. Die biologische Relevanz wird mit NICD KR Mutanten im bereits etablierten Zebrafisch-Neurogenese Model (in Kollaboration mit Drs. F. Oswald und S. Just, Ulm) überprüft. Das vorgeschlagene Projekt soll die Rolle von HDAC3 in der Notch Signaltransduktion untersuchen. Eine potentiell wichtige Schlussfolgerung hierbei ist, dass niedrige Konzentrationen (nanomolare Mengen) an HDAC-Inhibitor einen grossen Effekt auf Notch1-vermittelten Erkrankungen wie Leukämie haben könnten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen