Das Epitranscriptom von Drosophila melanogaster
Biochemie
Entwicklungsbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Gesamtheit der RNA-Moleküle einer Zelle in einem bestimmten biologischen Kontext, das so genannte Transkriptom, wird durch das Vorhandensein von nicht-kanonischen Nukleosiden komplexer gestaltet. Die Einbeziehung solcher RNA-Modifikationen führt vom Transkriptom zum Epitranskriptom, wo die Modifikationen strukturelle und regulatorische Funktionen ausüben, von denen viele noch unbekannt sind. Modifikationen treten sowohl in den meisten nichtcodierenden RNAs als auch in mRNA auf, wobei das häufige Vorhandensein von N6- Methyladenosin (m6A) die Modifikationsforschung in Eukaryonten dominiert, trotz technischer Unzulänglichkeiten bei der Lokalisierung ("Kartierung") von m6A. Ein umfassendes Verständnis des Epitranskriptoms erfordert die Kenntnis der Modifikationsarten und -stellen sowie der Modifikationsenzyme und der molekularen Mechanismen, die auf die Modifikationen reagieren. Besagte Aspekte sind in verschiedenen Modellorganismen untersucht worden, aber in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist nur wenig bekannt. Die Aufgaben des aktuellen Projekts bestanden darin, Faktoren in der Fruchtfliege zu identifizieren, die am katalytischen Mechanismus der m6A-Synthese in mRNA beteiligt sind, und eine verbesserte Nachweismethode zu entwickeln, mit der m6A mit einer Auflösung von einem Nukleotid quantitativ nachgewiesen werden kann. Ein weiteres Ziel war es, die Anfänge einer Sammlung von Knockout-Organismen von Modifikationsenzymen zu erzeugen, um deren Auswirkungen auf den Stoffwechsel und das Verhalten der Fruchtfliege zu untersuchen. Dementsprechend wurden im Laufe des Projekts zwei Proteine, nämlich Zc3h13/Flacc und Hakai, als Proteinkomponenten des m6A-Methyltransferase-Komplexes in Drosophila charakterisiert. Darüber hinaus wurde eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von m6A mit Einzelnukleotidauflösung entwickelt, die auf der chemischen Desaminierung von exozyklischen Aminfunktionen in Nukleobasen mit salpetriger Säure basiert. Die Anwendung dieser Methode wurde nur für bestimmte Amplikons entwickelt, da Probleme mit der Ausbeute bei der reversen Transkription der desaminierten RNA eine breite Anwendung im Transkriptom verhinderten. Schließlich wurden Knockout-Organismen für eine Reihe von tRNA-Modifikationen erzeugt und deren grundlegende Eigenschaften charakterisiert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Zc3h13/Flacc is required for adenosine methylation by bridging the mRNA-binding factor Rbm15/Spenito to the m6A machinery component Wtap/Fl(2)d. Genes & Development, 32(5-6), 415-429.
Knuckles, Philip; Lence, Tina; Haussmann, Irmgard U.; Jacob, Dominik; Kreim, Nastasja; Carl, Sarah H.; Masiello, Irene; Hares, Tina; Villaseñor, Rodrigo; Hess, Daniel; Andrade-Navarro, Miguel A.; Biggiogera, Marco; Helm, Mark; Soller, Matthias; Bühler, Marc & Roignant, Jean-Yves
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NOseq: amplicon sequencing evaluation method for RNA m6A sites after chemical deamination. Nucleic Acids Research, 49(4), e23-e23.
Werner, Stephan; Galliot, Aurellia; Pichot, Florian; Kemmer, Thomas; Marchand, Virginie; Sednev, Maksim V; Lence, Tina; Roignant, Jean-Yves; König, Julian; Höbartner, Claudia; Motorin, Yuri; Hildebrandt, Andreas & Helm, Mark
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Hakai is required for stabilization of core components of the m6A mRNA methylation machinery. Nature Communications, 12(1).
Bawankar, Praveen; Lence, Tina; Paolantoni, Chiara; Haussmann, Irmgard U.; Kazlauskiene, Migle; Jacob, Dominik; Heidelberger, Jan B.; Richter, Florian M.; Nallasivan, Mohanakarthik P.; Morin, Violeta; Kreim, Nastasja; Beli, Petra; Helm, Mark; Jinek, Martin; Soller, Matthias & Roignant, Jean-Yves
