Proteintopologie am Dictyostelium Centrosom

• Antragstellerin: Dr. Irene Meyer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 394020894

Centrosomen sind die Haupt-Mikrotubuliorganisationszentren der Zelle und spielen daher eine grundlegende Rolle beim Erhalt der Zellarchitektur und der Passage durch den Zellzyklus. Sie gehen zurück auf den letzten gemeinsamen Vorfahren aller Eukaryoten. Daher gibt es sie in allen eukaryotischen Supergruppen, wenngleich auch mit teils sehr unterschiedlichen Erscheinungsbildern. Organismen, die in wenigstens einem Zelltyp Cilien oder Flagellen aufweisen, besitzen Centrosomen mit Centriolen, die gleichzeitig auch als Basalkörper für die Cilienbildung dienen können. Im Gegensatz dazu besitzen Organismen ohne Cilien als Fortbewegungsorgan, wie z. B. viele Pilze oder Amoebozoen, üblicherweise Centrosomen ohne Centriolen. Als Repräsentanten der letzteren Gruppe untersuchen wir das Centrosom (im Englischen auch als "nucleus-associated body" bezeichnet) in Dictyostelium Amöben. Diese sind sehr gut geeignet, um jene centrosomalen Funktionen zu untersuchen, die unabhängig von der Gegenwart von Centriolen sind. Anstelle von Centriolen besitzt das Dictyostelium Centrosom eine dreilagige Zentralstruktur, die in einer Matrix mit Mikrotubuli-Nukleationskomplexen, der Corona, eingebettet ist. Wir haben inzwischen die meisten, wenn nicht gar alle strukturellen Centrosomkomponenten auf molekularer Ebene charakterisiert. Während die meisten individuellen Komponenten entweder der Zentralstruktur oder der Corona zugeordnet werden konnten, steckt die Aufklärung der genaueren subcentrosomalen Proteintopologie und wechselseitigen Proteininteraktionen noch in ihren Anfängen. Mit unserem Arbeitsprogramm adressieren wir die folgende Fragen - Welche Proteine vermitteln die Interaktion der äußeren Lagen der Zentralstruktur mit der Corona?- Welche Proteine vermitteln die Interaktion der äußeren Lagen mit der zentralen Lage?- Welche Proteine interagieren mit den -Tubulin-haltigen Knötchen in der corona, und/oder agieren als Gerüstproteine?Zur Beantwortung dieser Fragen werden wir die "proximity-dependent biotin identification"-Methode (BioID) mit Hochauflösungslichtmikroskopie (STED, dSTORM) und Elektronenmikroskopie kombinieren, um die Protein-Protein-Wechselwirkungen zu charakterisieren und eine detailierte topologische Karte der Proteinlokalisationen am Centrosom zu zeichnen. Um die Notwendigkeit hochspezifischer Antikörper für jedes einzelne Protein zu umgehen und um die mikroskopische Auflösung zu optimieren, werden wir "Knock-in"-Stämme herstellen, in denen das jeweilige endogene Protein durch eine über den ensprechenden endogenen Promotor exprimierte "getaggte" Version ersetzt wird. Die "Tags" werden mithilfe von fluoreszenzmarkierten "Tag-spezifischen Nanobodies" oder, im Falle von Elektronenmikroskopie, mit Ni-NTA-Nanogold oder gold-markierten "Nanobodies" sichtbar gemacht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Ralph Gräf