Untersuchung von TBX5 assoziierten regulatorischen Prozessen in der humanen kardialen Embryonalentwicklung unter Verwendung eines patienten-spezifischen Holt-Oram Syndrom iPS Modells

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Lesca Miriam Holdt; Professor Dr. Markus Krane
• Fachliche Zuordnung: Herz- und Gefäßchirurgie ; Entwicklungsbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 394237736

Die Funktion von TBX5 wurde bislang in unterschiedlichen Tiermodellen detailliert untersucht. Die Translation dieser Erkenntnisse in den humanen Bereich fehlt. In diesem Projekt soll unter Verwendung eines patientenspezifischen humanen iPS (hiPS) Modells für das Holt-Oram Syndrom (HOS), die Rolle von TBX5 in der humanen kardialen Entwicklung untersucht werden. In Vorarbeiten konnten wir eine bislang nicht beschriebene Pro85Thr de novo loss-of-function Mutation im TBX5 Gen nachweisen, die einen dramatischem HOS Phänotyp im Patienten hervorruft. Der Mechanismus des massiven Funktionsverlusts liegt in einer Konformationsänderung des TBX5 bei erhaltener Zellkerngängigkeit. Ferner konnten wir an integrationsfrei-reprogrammierten hiPS Linien TBX5 Wildtyp (TBX5-iPSWT) vs. TBX5 Pro85Thr Mutante (TBX5-iPSMUT) einen ersten in vitro Phänotyp erarbeiten.In dem beantragten Projekt sollen, basierend auf den hiPS Linien TBX5-iPSWT und TBX5-iPSMUT detaillierte Unterschiede im Transkriptom während der kardialen Differenzierung unter Verwendung der Hochdurchsatzsequenzierung herausgearbeitet werden (RNA-Seq). Die Differenzierung der hiPS Linien erfolgt unter Verwendung eines Protokolls zur gerichteten kardialen Differenzierung (80-90% Reinheit von Kardiomyozyten). Somit ist die Darstellung gering exprimierter Gene in der Sequenzierung sicher gewährleistet. Im Weiteren werden transgene Linien (TBX5-iPSWT/flag, TBX5-iPSMUT/flag) hergestellt, bei denen über einen spezifischen FLAG-Antikörper eine Detektion des TBX5 Proteins möglich ist. Dies ist notwendig, da bislang kein hochspezifischer Antikörper zur Detektion von TBX5 zur Verfügung steht. Die Herstellung der transgenen Linien erfolgt mittels CRISPR/Cas, wobei die FLAG Sequenz zwischen Exon 9 und dem Stop-Codon eingebracht wird. Unter Verwendung der transgenen Linien werden mittels ChIP-Seq Unterschiede bei den Bindungsmotiven und der Bindungsdynamik zwischen TBX5WT und TBX5MUT herausgearbeitet. Die kombinierte Analyse aus spezifischen Transkriptom Daten (RNA-Seq, gerichtete Differenzierung) und hochspezifischen ChIP-Seq Daten (FLAG-pull-down) erlaubt die zuverlässige Beurteilung des Expressionsprofils, der benötigten Bindungsmotive und Bindungsdynamik von TBX5 und möglicher off-target Effekte unter Berücksichtigung des HOS Phänotyps. Die Ergebnisse werden in einer hiPS Linie eines HOS Patienten, der keine TBX5 Mutation trägt, validiert.Das beantragte Projekt zur Untersuchung von TBX5 in einem patienten-spezifischen hiPS Modell für das HOS ist bislang einzigartig. Die Arbeit wird detaillierte Einblicke in die Rolle des TBX5 Proteins in der humanen kardialen Entwicklung geben, da neben einer Expressionsanalyse innerhalb der kardialen Differenzierung auch eine spezifische Detektion des Proteins mit Hilfe transgener Linien möglich ist. Zudem ist das Projekt für Untersuchungen niedrig exprimierter Gene (z.B. Transkriptionsfaktoren), mit essentieller Rolle in der humanen Entwicklung in einem hiPS Modell wegweisend.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich(e): Dr. Martina Dreßen