Charakterisierung ribosomaler Stalling-Sequenzen und deren Erkennung durch RQT Qualitätskontroll-Faktoren

• Antragsteller: Professor Dr. Roland Beckmann
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 394323889

Mechanismen zur mRNA- und Protein-Qualitätskontrolle sind entstanden, um die Zelle vor toxischen Proteinsynthese-Intermediaten zu schützen. Das Anhalten des Ribosoms (Stalling) während der Translation von defekten mRNAs ist hierbei ein entscheidendes Merkmal. Doch nicht nur defekte mRNA sondern auch spezifische nicht-optimale Kodon-Paare sowie mRNAs, die für polybasiche Aminosäuresequenzen kodieren, führen zu Stalling des Ribosoms. Hier wirkt das gebremste Ribosom als Signal, das einen nachgelagerten Abbauweg für die defekten Proteinprodukte auslöst, den man RQC (Ribosomen-assoziierte Qualitäts-Kontrolle) nennt.Im vorgeschlagenen Projekt sollen die Mechanismen für spezifische mRNA basierte Stalling-Ereignisse und deren Erkennung durch nachgelagerte Faktoren molekular charakterisiert werden. Die drei zentralen Fragen sind hierbei: (i) Welche spezifischen strukturellen Besonderheiten treten bei 80S-Ribosomen auf, die durch diese mRNA-Sequenzen zum Stehen gebracht wurden, (ii) wie werden stehengebliebene Ribosomen erkannt, und (iii) wie wird dadurch die RQC-Antwort ausgelöst. Bei allen drei Aspekten soll Kryo-Elektronen-Mikroskopie zur Strukturaufklärung verwendet werden. Hit Hilfe eines etablierten, modifizierbaren mRNA-Reporter-Systems sollen zunächst 80S Ribosomen isoliert werden, die durch bereits bekannte spezifische mRNA-Sequenzen (verschiedene polybasische Sequenzen und Tandem-Kodons) gestallt wurden. Kryo-EM-Strukuren sollen hier Einsicht in die molekulare Natur dieser Stalling-Ereignisse geben. Im zweiten Schritt sollen diese Ribosomen im Komplex mit Hel2 strukturell charakterisiert werden. Hel2 ist eine E3-Ligase, die die stehen gebliebenen Ribosomen erkennt und durch Ubiquitinierung ribosomaler Proteine die RQC-Antwort einleitet. 80S-Hel2-Komplexe sollen hierfür entweder in vitro aus gereinigten Komponenten oder direkt aus Hefezellen gewonnen werden. Die Struktur eines solchen Komplexes soll beantworten, welche Merkmale des spezifisch gestallten 80S Ribosoms durch Hel2 erkannt werden und wie dadurch die RQC-Antwort eingeleitet wird. Als letzter Schritt soll die Struktur des 80S-gebundenen RQT (RQC-triggering) Komplexes gelöst werden. Neben Hel2 werden die drei Proteine Slh1, Cue3 und Ykr023w ebenso für die Einleitung der RQC-Antwort benötigt, und binden gestallte Ribosomen unabhängig von Hel2. Die molekulare Wirkungsweise des RQT-Komplexes und die mechanistischen Zusammenhänge beim Auslösen der RQC-Antwort sind bislang unklar. Analog zu 80S-Hel2-Komplexen sollen daher die 80S-RQT-Komplexe nativ aus Hefe gereinigt werden. Zudem ist geplant, die einzelnen Komponenten mit Hilfe bakterieller oder eukaryotischer Expressions-Systeme zu reinigen und dann mit gestallten Ribosomen zu rekonstituieren. Auch hier sollen Kryo-EM-Strukturen die molekulare Architektur der Komplexe aufklären und Hinweise geben, wie die RQT-Proteine mit gestallten 80S Ribsomen interagieren und dort die RQC-Antwort auslösen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen