Untersuchungen zu gemischten Ubiquitinketten und Kettenkonformationen

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Dötsch; Professor Dr. Thomas Sommer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2017 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 394619424

• Erstellungsjahr: 2024

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Ubiquitinierung ist eine wesentliche posttranslationale Modifikation, die viele Prozesse reguliert. Bisher konzentrierte sich die ub-Forschung vor allem auf die Untersuchung homogen verknüpfter Polyubiquitinketten. Es gibt jedoch immer mehr Hinweise darauf, dass Ketten mit mehr als einem Verknüpfungstyp in vivo entweder in Form von gemischten Verknüpfungsketten oder verzweigten Ketten existieren. In diesem Förderantrag wollten wir die Beteiligung des E2-Enzyms Ubc1 und insbesondere seiner UBA-Domäne am Aufbau von K48/K63-verzweigten Ketten untersuchen. Mittels Massenspektrometrie konnten wir proteomische Veränderungen erkennen, die auf eine Funktion der Ubc1-generierten ub- Verzweigung beim Chromatin-Remodelling und bei zellulären Stressreaktionswegen im Zusammenhang mit der DNA-Replikation in S. cerevisiae hinweisen. Um Proteine zu identifizieren, die an verzweigte ub-Ketten binden, haben wir ein ub-Interaktor-Screening durchgeführt. Wir konnten einige der ersten K48/K63-Interaktoren der verzweigten Ubiquitinkette identifizieren, darunter das Huntingtin-interagierende Protein HIP1, die E3- Ligase UBR4 und den DNA-Replikations- und Reparaturfaktor RFC1. Schließlich haben wir eine EPR-basierte Methode und ein Berechnungsprotokoll entwickelt, um den Konformationsraum von ub kovalent gebunden an ein E2-Enzym, in diesem Fall Hefe Ubc7, zu bestimmen. In Titrationsexperimenten konnten wir zeigen, dass die RING-Domäne E3-Ligase Doa10 zu einer Verkleinerung des Konformationsraums führt und den Komplex in eine geschlossene Konformation drängt. Im Gegensatz dazu veränderte die RING-E3-Ligase Hrd1 den Konformationsraum nicht, sondern beschleunigte den ub-Transfer durch allosterische Modulation in der Nähe des Cysteins im aktiven Zentrum.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• The UBA domain of conjugating enzyme Ubc1/Ube2K facilitates assembly of K48/K63‐branched ubiquitin chains. The EMBO Journal, 40(6).
  Pluska, Lukas; Jarosch, Ernst; Zauber, Henrik; Kniss, Andreas; Waltho, Anita; Bagola, Katrin; von Delbrück, Maximilian; Löhr, Frank; Schulman, Brenda A.; Selbach, Matthias; Dötsch, Volker & Sommer, Thomas