Massiv-parallele Reporterassays (MPRA) zur funktionellen Aufarbeitung nicht-kodierender häufiger Risikovarianten für nichtsyndromale Lippen-Kiefer-Gaumenspalten.

• Antragstellerin: Dr. Kerstin Ludwig
• Fachliche Zuordnung: Humangenetik
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 396961086

Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben umfassende Erkenntnisse zu genetischen Risikofaktoren in komplexgenetischen Erkrankungen generiert. Die Übersetzung dieser Befunde in biologisch-relevante Abläufe ist bisher jedoch sehr unzureichend, ebenso wie unser Verständnis dessen, wie genau die assoziierten Risikovarianten molekulare Prozesse beeinflussen. Gründe hierfür sind u.a. die Lokalisation der Signale in nicht-proteinkodierenden Regionen, die Haplotypstruktur des menschlichen Genoms, sowie die eingeschränkte Verfügbarkeit von Hochdurchsatzverfahren in der funktionellen Aufarbeitung. Aufgrund des Kopplungsungleichgewichtes ist eine Abtrennung kausaler (driver)-Varianten von den mit ihnen gemeinsam vererbten benignen (passenger) Varianten mit statistischen Methoden allein nicht möglich. Bisherige Methoden zur funktionellen Aufarbeitung umfassen indirekte (z.B. ChIPSeq) und direkte (z.B. Reporterassays) Methoden: Indirekte Verfahren beschreiben allg. regulatorische Zustände eines DNA-Abschnitts in einem Zellsystem, können jedoch keine Aussagen zum Effekt einzelner genetischer Varianten treffen. Direkte Methoden können für allel-spezifische Aussagen eingesetzt werden, sind jedoch aufgrund des limitierten Durchsatzes für die Analyse mehrerer Varianten gleichzeitig extrem ineffizient und weisen eine limitierte Sensitivität für die niedrigen Effektstärken von Risikoallelen komplexgenetischer Phänotypen auf.Diese Einschränkungen gelten auch für die nichtsyndromalen orofazialen Spalten (nsOFC), eine der häufigsten Fehlbildungen des Menschen: zwar wurden durch GWAS bisher etwa 40 genetische Risikoloci identifiziert (meist in nicht-kodierenden Bereichen des Genoms), jedoch ist bisher nicht klar, wie diese Regionen biologisch das Risiko für eine nsOFC vermitteln. Durch die Einführung von Hochdurchsatz-Technologien (z.B. Next-Generation-Sequencing (NGS)) wurden kürzlich quantitative Methoden zur Charakterisierung von regulatorischen Effekten im Hochdurchsatz ermöglicht. Eine dieser Methoden, der massiv-parallele Reporterassay (MPRA) ermöglicht es, Tausende Varianten und/oder Risikoregionen in einem einzigen Experiment zu untersuchen. Das Prinzip der MPRA beruht dabei auf: (i) der Synthese von Oligonukleotiden mit potentiellen regulatorischen Elementen und ihren allelischen Ausprägungen, (ii) dem Einbringen von mit molekularen Barcodes ausgestatteten Reporter-Libraries in humane Zellen, und (iii) der Quantifizierung der Barcodes mittels NGS. Im vorliegenden Projekt soll der MPRA im Labor implementiert und zunächst für die bereits bekannten nsOFC-Risikoloci in humanen embryonalen Mesenchymzellen der Gaumenplatten (HEPM-Zellen) angewandt werden. Neben den systematischen Einblicken, die dadurch in die Pathogenese der nsOFC gewonnen werden, kann diese Methode unter Verwendung verschiedener Zelltypen in Zukunft auch auf andere Phänotypen übertragen werden und beitragen, funktionelle und molekulare Grundlagen komplexgenetischer Erkrankungen zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen