Hochdynamische Multianalyt-Assays - Die gleichzeitige Detektion von Nukleinsäuren und Proteinen in einem Schritt
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Projekt Multianalyt wurde an einem neuen Assaykonzept für die gleichzeitige Detektion von DNA und Protein Biomarkern aus einer Probe geforscht, dessen Machbarkeit gezeigt und anhand von Beispielmarkern charakterisiert. Die gleichzeitige Detektion von unterschiedlichen Biomolekülklassen ist für eine Vielzahl an Anwendungsbereichen von hohem Interesse unter anderem für die In-vitro- Diagnostik. In diesem Zusammenhang hat eine gleichzeitige Detektion von Erregern und Entzündungsmarkern den Vorteil, dass der behandelnde Arzt (1) erkennt, ob eine klinisch relevante Infektion vorhanden ist und (2) bei der Entscheidung hinsichtlich erregerspezifische Therapie unterstützt wird. Daher wurde für die Entwicklung und Erforschung des Multianaly-Assays die gleichzeitige Detektion der Beispielmarker IL-6 (ein proinflammatorisches Zytokin) und P. aeruginosa (opportunistischer Erreger) aus akuten Wunden angestrebt. Dies wurde realisiert, indem P. aeruginosa gDNA in Anwesenheit von IL-6 mittels Protein-kompatibler Amplifikationsmethode vervielfältigt und markiert wurde (Nukleinsäure-zu-Protein Umwandlung). Im nächsten Schritt konnte dann eine gleichzeitige Detektion von Ziel-Protein und markiertem Amplifikationsprodukt mit demselben Messprinzip – einem Sandwich-Immunoassay - erfolgen. Der entwickelte Multianalyt-Assay kann unabhängig von der Plattform genutzt werden. So konnten wir eine generelle Machbarkeit des Assaykonzeptes in einer Mikrotiterplatte wie auch mittels Lateral Flow Test zeigen. Die Kombination aus schneller, isothermer Amplifikation und Lateral Flow Detektion ist ideal für Anwendungen im POC Bereich. Die analytische Leistungsfähigkeit des Multianalyt-Lateral Flow Immunoassays wurde evaluiert. Dabei konnten wir für die gleichzeitige Detektion von IL-6 und P. aeruginosa gDNA ein Detektionslimit von 4 ng/mL und 70 Kopien/Reaktion ermitteln. Aktuell erfolgt der Nachweis aus Puffer, in der Anwendung soll jedoch eine entsprechende Probenvorbereitung stattfinden, die eine gleichzeitige Detektion von P. aeruginosa und IL-6 aus Wundexsudat ermöglicht. Während IL-6 freizugänglich im Wundexsudat vorliegt, muss P. aeruginosa erst lysiert werden, um einen Nachweis der gDNA zu ermöglichen. Daher wurde in diesem Projekt auch die Möglichkeit einer Probenvorbereitung mittels Bead Beating untersucht. Hier zeigte sich jedoch, dass durch die Hitzeentwicklung ein Großteil des Proteins denaturierte. Daher wurde an einem neuen Konzept für eine Multianalyt-kompatible Probenvorbereitung geforscht. Für einen vielversprechenden Ansatz halten wir die Lyse mittels AMP. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass (1) P. aeruginosa durch die Verwendung von AMP lysiert werden kann und (2) eine gleichzeitige Detektion von DNA und Protein erfolgen kann. Die weitere Untersuchung dieses Ansatzes soll Gegenstand eines Folgeprojekts sein. Die Detektion von IL-6 und P. aeruginosa soll in der Anwendung aus Wundexsudat erfolgen. Für eine Vergleichsstudie zwischen Multianalyt-Lateral Flow Test und Laboruntersuchungen wurde am Uniklinikum Frankfurt Wundflüssigkeit von Patienten mit und ohne postoperativer Wundinfektion gesammelt (Probennahme 2, 24 und 48 Stunden postoperativ). Aufgrund der fehlenden Probenvorbereitung konnte die Vergleichsstudie nicht durchgeführt werden jedoch wurden am Uniklinikum erste Proben hinsichtlich der IL-6 Verlaufskonzentration analysiert. Hier konnte beobachtet werden, dass die IL-6 Konzentration bei Patienten mit Wundinfektion insgesamt höher war und langsamer abfiel. Dies lässt vermuten, dass IL-6 ein geeigneter Verlaufsmarker für die Bewertung von postoperativen Wunden darstellt. Des Weiteren konnte wir bereits eine generelle Detektion von IL-6 oder P. aeruginosa aus Wundexsudat (versetzt mit definierten Konzentration an Analyt) mittels Referenzassay zeigen. Aufgrund der vielversprechenden Ergebnisse wurde der neue entwickelte Ansatz zur gleichzeitigen Detektion von unterschiedlichen Biomolekülklassen zum Patent angemeldet. In Folgeprojekten sollen offene Fragestellungen hinsichtlich der Probenvorbereitung, der Integration des Workflows in eine Lateral Flow-basierte Plattform, und einer Korrelation zwischen Immunmarkern und dem Infektions-/Heilungsprozess erforscht und beantwortet werden. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass wir auf ein erfolgreiches Projekt zurückblicken, in dem nicht nur erfolgreich ein neuartiger Assay erforscht und etabliert wurde, sondern auch neue Erkenntnisse hinsichtlich Multianalytkompatibler Probenvorbereitung und dem Verlauf von proinflammatorischen Markern (IL-6) in Wundexsudat von Patienten mit oder ohne Wundinfektion gewonnen wurden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2019): Sensitive detection of Pseudomonas aeruginosa based on recombinase polymerase amplification combined with an immunological assay. 06.-09.05.2019. Lissabon/Portugal: Molecular Diagnostics Europe
Brunauer, Anna; Stetten, Felix von; Früh, Susanna M.
- (2020). Multianalyte Assay for the simultaneous detection of nucleic acid and analytes. EP application number: EP20189814.5. Europäisches Patentamt
Früh, Susanna M.; Brunauer, Anna
- (2020): Integrated paper-based sensing devices for diagnostic applications. In: Paper Based Sensors, Bd. 89: Elsevier (Comprehensive Analytical Chemistry), S. 397-450
Brunauer, Anna; Ates, H. Ceren; Dincer, Can; Früh, Susanna M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/bs.coac.2020.03.003) - (2021): Integrated Devices for Non‐Invasive Diagnostics. In: Adv. Funct. Mater., S. 2010388
Ates, Hatice Ceren; Brunauer, Anna; Stetten, Felix; Urban, Gerald A.; Güder, Firat; Merkoçi, Arben et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1002/adfm.202010388) - (2021): Rapid Detection of Pathogens in Wound Exudate via Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassay. In: Biosensors 11 (3)
Brunauer, Anna; Verboket, René D.; Kainz, Daniel M.; Stetten, Felix von; Früh, Susanna M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.3390/bios11030074) - (2021): Rapid nucleic acid lateral flow immunoassay for the detection of Pseudomonas aeruginosa. 26.-29.07.2021. Online: Biosensors
Brunauer, Anna; Verboket, René D.; Kainz, Daniel M.; Stetten, Felix von; Früh, Susanna M.
- (2021): Simultaneous detection of protein and nucleic acid biomarkers via paper-based multianalyte sensor. 10.-14.10.2021. Online: Micro-TAS
Klebes, Anna; Kittel, Anna-Sophia; Verboket, René D.; Stetten, Felix von; Früh, Susanna M.
- (2021): Site-Specifically-Labeled Antibodies for Super-Resolution Microscopy Reveal In Situ Linkage Errors. In: ACS nano
Früh, Susanna M.; Matti, Ulf; Spycher, Philipp R.; Rubini, Marina; Lickert, Sebastian; Schlichthaerle, Thomas et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1021/acsnano.1c03677) - (2022): Multianalyte lateral flow immunoassay for simultaneous detection of protein-based inflammation biomarkers and pathogen DNA. In: Sensors and Actuators B: Chemical 355, S. 131283
Klebes, Anna; Kittel, Anna-Sophia; Verboket, René D.; Stetten, Felix von; Früh, Susanna M.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.snb.2021.131283)
