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Projekt
Pathway Engineering zur Optimierung des homologieabhängigen therapeutischen Genome Editings des ABCA4-Lokus in Photorezeptoren
Antragsteller
Professor Dr. Volker Busskamp, Ph.D.; Professor Dr. Knut Stieger
Fachliche Zuordnung
Augenheilkunde
Förderung
Förderung seit 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 399432863
Mutationen in mehr als 200 netzhautspezifischen Genen wurden mit erblichen Netzhauterkrankungen in Verbindung gebracht. Für mehrere Netzhauterkrankungen wurden gentherapeutische Verfahren entwickelt, bei denen AAV-Vektoren (Adeno-assoziierte Viren) für den Gentransfer eingesetzt wurden. Da sich AAVs nur zum Transfer von kurzen cDNA Sequenzen eignen, überschreiten viele der am häufigsten mutierten Gene, wie zum Beispiel das ABCA4 Gen, die maximale Größe dessen, was per AAV transferiert werden kann. Mutationen im ABCA4 Gen sind die Ursache für Morbus Stargardt, eine früh einsetzende Form der Makuladegeneration. Aufgrund der Größe des ABCA4 Gens stellt das Gene Editing einen attraktiven Ansatz dar, um die Mutation im Genom der Photorezeptoren von Patienten zu korrigieren. Präzises Gene Editing zur Vermeidung unkontrollierter zusätzlicher genomischer Veränderungen erfordert eine homologie-abhängige Doppelstrangbruch-Reparatur (DSB). Da die DSB-Reparaturmechanismen im Zellzyklus variieren, haben wir in der ersten SPP2127-Förderperiode untersucht und nachgewiesen, dass eine präzise DSB-Reparatur in postmitotischen Nervenzellen, zu denen Photorezeptoren zählen, stattfindet. Darüber hinaus konnten wir durch Modifikationen der DSB Mechanismen die Präzision der Reparatur weiter verbessern. Wir haben außerdem aus menschlichen Stammzellen gewonnene Nervenzellen als geeignetes in vitro Modell charakterisiert, um alle experimentellen Parameter für präzises Genome Editing zu testen. Darüber hinaus ist die DSB-Aktivität in gesunden und kranken murinen und menschlichen Photorezeptoren unverändert. Auf der Grundlage unserer bisherigen Studien werden wir alle molekularen Werkzeuge für das DSB-Pathway-Engineering, gRNAs, ABCA4- und DSB-Reporter-Konstrukte erstellen und systematisch im in vitro Nervenzellmodell anwenden, um die optimalen Parameter für eine präzise Reparatur zu ermitteln. Wir werden auch eine ABCA4-mutierte humane Stammzelllinie erzeugen, die wir zur Herstellung von Netzhautorganoiden verwenden werden. Diese mit unseren experimentellen Ansätzen behandelten 3D-Organoide werden mit bildgebenden Verfahren sowie mit transkriptombasierten, genomischen und quantitativen proteomischen Messungen untersucht. Letztendlich werden wir unseren Ansatz auch in einem Mausmodell für Morbus Stargardt testen, um das Abca4-Gen in vivo zu korrigieren. Die behandelten Mäuse werden mittels Live-Bildgebung, Verhaltenstests und Elektrophysiologie untersucht. On- und potenzielle Off-Target-Effekte werden durch Sequenzierung aufgedeckt. Der Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit in vivo sowie der Einsatz hochentwickelter humaner in vitro Modelle für die Korrektur des ABCA4-Locus vereinfacht und ebnet den Weg für eine zukünftige klinische Umsetzung. Unsere Proof-of-Concept-Studie für präzises Gene Editing einschließlich DSB-Pathway-Engineering wird auch für andere therapeutische Interventionen bei Netzhauterkrankungen, und allgemein in Nervenzellen, aufschlussreich sein.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
