Kontextspezifische Regulation der Notch Signalaktivität durch Phosphorylierung von Suppressor of Hairless in Drosophila

• Antragstellerin: Privatdozentin Dr. Anja Christina Nagel
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 400152242

• Erstellungsjahr: 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Differenzierung und Homöostase von Zellen unterliegen in Metazoen dem fein koordinierten Zusammenspiel weniger Signalkaskaden, wie dem Notch Signalweg. Hierbei ist die exakte Zeit/Raum-Regulation der Aktivität des Notch-Signals sehr wichtig; Störungen gehen mit ernsten Erkrankungen, beispielsweise Krebs, einher. Zentraler Schalter der Signalübertragung ist CSL/Su(H), der als Transkriptionsfaktor Notch-Zielgene reguliert und somit die Notch- Aktivität in der Zelle weiterleitet. In Drosophila melanogaster unterliegt Su(H) einer Phosphorylierung an Serin 269 (S269), die seine DNA-Bindung und damit die Notch-Aktivität beeinträchtigt. Ziel dieses Projekts war es, diesen neuartigen Regulationsmechanismus genauer zu untersuchen, da er eine kontextspezifische, zeitweise Inaktivierung der Notch-Aktivität in Antwort auf innere wie äußere Signale via Proteinkinasen darstellen könnte. Wir konzentrierten uns auf die Hämatopoese, da wir die Su(H)-Phosphorylierung ursprünglich in Zellen mit Blutzellcharakter gefunden hatten. Das Notch-Signal fördert die Entstehung sogenannter Kristallzellen, eine von drei Blutzelltypen in Drosophila. Es wurden spezifische Su(H) Mutanten erzeugt, bei denen das wildtypische Su(H) Gen mittels Genom-Engineering durch eine phospho-defiziente (Su(H)S269A) bzw. phospho-mimetische (Su(H)S269D) Variante ersetzt wurde. Erwartungsgemäß zeigte die Su(H)S269D Mutante einen vollständigen Ausfall der Notch- Aktivität, da die DNA-Bindung Voraussetzung der Su(H) Funktion ist. Hingegen wies das Su(H)S269A Allel in allen Phasen der Blutzellentwicklung zu viele Kristallzellen auf. Wir fanden keinen Einfluss des allgemeinen Notch-Antagonisten Hairless auf die Kristallzellbildung, was die Spezifität der Kinase-vermittelten Repression der Notch-Aktivität untermauert. Die S269- Phosphorylierung von Su(H) stellt demnach einen generellen Regulationsmechanismus der Notch-Aktivität im Kontext der gesamten Hämatopoese dar. Es wurden Fliegen erzeugt, die anstelle von Su(H) das orthologe RBPJ-Gen der Maus mit den entsprechenden Mutationen trugen: diese wiesen vergleichbare Blutzelldefekte auf, was auf eine mögliche Konservierung dieser Regulation hinweist. Die Blutzellen in Drosophila sichern insbesondere die Immunantwort. So führt ein Befall mit parasitoiden Wespen zu einer starken Vermehrung von Lamellozyten, d.h. Blutzellen, die das Wespenei einkapseln. Diese kommen normalerweise nicht vor und werden auf Kosten der Kristallzellen gebildet. Dazu muss der Notch-Signalweg inhibiert werden, was durch eine Su(H)-Phosphorylierung erfolgen könnte, d.h. eine infektionsinduzierte Stressantwort, die das Notch-Signal zugunsten der Lamellozytenbildung hemmt. Diese Arbeitshypothese konnten wir nun untermauern: so ist die Immunantwort des Su(H)S269A Allels bei Wespenbefall abgeschwächt. Zudem resultiert dieser in vivo in der S269 Phosphorylierung von Su(H). In silico, in vitro und in vivo Screens führten anschließend zur Identifizierung der Proteinkinase Pkc53E, die an der stressinduzierten Phosphorylierung von Su(H) beteiligt ist. Untersuchung in humaner Zellkultur, sowie die hohe strukturelle und funktionelle Konservierung der CSL-Proteine und der PKC-Familie legen nahe, dass auch in Säugern CSL einer negativen Regulation durch kontextspezifische Phosphorylierung unterliegt.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• An RBPJ-Drosophila Model Reveals Dependence of RBPJ Protein Stability on the Formation of Transcription–Regulator Complexes. Cells, 8(10), 1252.
  Gahr, Bernd M.; Brändle, Franziska; Zimmermann, Mirjam & Nagel, Anja C.
  
• Limited Availability of General Co-Repressors Uncovered in an Overexpression Context during Wing Venation in Drosophila melanogaster. Genes, 11(10), 1141.
  Nagel, Anja C.; Maier, Dieter; Scharpf, Janika; Ketelhut, Manuela & Preiss, Anette
  
• Nucleo-cytoplasmic shuttling of murine RBPJ by Hairless protein matches that of Su(H) protein in the model system Drosophila melanogaster. Hereditas, 158(1).
  Wolf, Dorina B.; Maier, Dieter & Nagel, Anja C.
  
• Phospho-Site Mutations in Transcription Factor Suppressor of Hairless Impact Notch Signaling Activity During Hematopoiesis in Drosophila. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9.
  Frankenreiter, Lisa; Gahr, Bernd M.; Schmid, Hannes; Zimmermann, Mirjam; Deichsel, Sebastian; Hoffmeister, Philipp; Turkiewicz, Aleksandra; Borggrefe, Tilman; Oswald, Franz & Nagel, Anja C.
  
• The Membrane-Bound Notch Regulator Mnr Supports Notch Cleavage and Signaling Activity in Drosophila melanogaster. Biomolecules, 11(11), 1672.
  Nagel, Anja C.; Müller, Dominik; Zimmermann, Mirjam & Preiss, Anette
  
• The Binding of CSL Proteins to Either Co-Activators or Co-Repressors Protects from Proteasomal Degradation Induced by MAPK-Dependent Phosphorylation. International Journal of Molecular Sciences, 23(20), 12336.
  Fechner, Johannes; Ketelhut, Manuela; Maier, Dieter; Preiss, Anette & Nagel, Anja C.
  
• Genetic and Molecular Interactions between HΔCT, a Novel Allele of the Notch Antagonist Hairless, and the Histone Chaperone Asf1 in Drosophila melanogaster. Genes, 14(1), 205.
  Maier, Dieter; Bauer, Milena; Boger, Mike; Sanchez, Jimenez Anna; Yuan, Zhenyu; Fechner, Johannes; Scharpf, Janika; Kovall, Rhett A.; Preiss, Anette & Nagel, Anja C.
  
• Inhibition of the Notch signal transducer CSL by Pkc53E-mediated phosphorylation to fend off parasitic immune challenge inDrosophila. Cold Spring Harbor Laboratory.
  Deichsel, Sebastian; Frankenreiter, Lisa; Fechner, Johannes; Gahr, Bernd M.; Zimmermann, Mirjam; Mastel, Helena; Preis, Irina; Preiss, Anette & Nagel, Anja C.