Zeitaufgelöste Visualisierung der Hefe-Ribosomenbiogenese mittels Kryo-Elektronentomografie

• Antragsteller: Professor Dr. Achilleas Frangakis
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 400861327

In diesem Projekt möchten wir den Ursprung der Hefe-Ribosomenbiogenese mittels Kryo-Elektronentomografie (Kryo-ET) und korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) analysieren. Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Genexpression. Sie übersetzen die genetische Information der Boten-RNA (mRNA) in das Proteom der Zell. Die Bedeutung der Ribosomen und die Komplexizität ihrer Struktur erfordern einen gut-koordinierten und regulierten Zusammenbau. Fehlfunktionen dieses Prozesses sind meist letal für die Zelle und verursachen ernste Pathologie. Während reife Ribosomen gut untersucht sind, ist das strukturelle Verständnis ihrer Biogenese unklar. Die eukaryotische Ribosomenbiogenese beginnt im Nukleolus mit der Synthese eines ribosomalen RNA (rRNA) Vorläufers bei dem viele Faktoren mit diesem RNA Vorläufer assoziieren und die prä-ribosomalen Partikel bilden. Wir haben diese Partikel im Kontext von sogenannten "Miller Bäumen" visualisiert. "Miller Bäume" sind supramolekulare Strukturen mit einem ribosomalen DNA (rDNA) Rückgrat die aktiv transkribierende RNA Polymerase I (Pol I) Enzyme enthalten, von denen die neugebildeten rRNA- Ketten ausgehen und die sich zu den prä-ribosomalen Partikeln formen. Die prä-ribosomalen Partikel sind an den Enden der Äste der "Miller Bäume" lokalisiert und werden als terminale Partikel bezeichnet. So visualisieren die terminalen Partikel der "Miller Bäume" die schrittweise Erzeugung der Präribosomen in einer quasi-sequentiellen Abfolge.In diesem Antrag würden wir gerne die terminalen Partikel analysieren, die sich ko-transkriptionell an den 5'-Enden der neu-erzeugten rRNA durch schrittweises Hinzufügen von Proteinkomplexen bilden. Solch eine Analyse wird nur durch die definierte Lokalisation der sich ko-transkriptionell an den wachsenden prä-rRNAs der Äste der "Miller Bäume" bildenden Komplexe ermöglicht. In der Hefe ist die Bildung der terminalen Partikel ein zweistufiger Prozeß: Früh gebildete Partikel werden von der neugebildeten rRNA Kette abgespalten, um die kleine ribosomale Untereinheit zu bilden und werden daher "small subunit (SSU)" Prozessom genannt. Später gebildete Partikel werden sich zur großen ribosomalen Untereinheit entwickeln und werden daher als "large subunit (LSU)" Prozessom bezeichnet. Somit ist die Bildung der terminalen Partikel der früheste Vorläufer der letztendlichen ribosomalen Untereinheiten. Aufgrund ihrer Größe (etwa 6 MDa für das SSU Prozessom), ist die Kryo-Elektronentomografie ideal geeignet für die Analyse der terminalen Partikel. Weiterhin können durch die spezifische Markierung von definierten Stadien individuelle Stadien präzise lokalisiert werden, um unsere Analyse zu unterstützen. Letztendlich sollte diese Studie zu einem detaillierteren Verständnis der Struktur und Funktion der SSU und LSU Prozessomen führen und beispiellose Einblicke in den faszinierenden Mechansimus der frühen Ribosomenbiogenese in vivo geben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen