Charakterisierung der molekularen Schaltkreise zur Kontrolle der Aktivität pflanzlicher Cryptochrome
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Mechanismen der Aktivierung und Inaktivierung pflanzlicher Cryptochrom (CRY) Blaulichtphotorezeptoren waren zu Beginn dieses Projekts nur ansatzweise verstanden. Hinsichtlich der Aktivierung war bekannt, dass der Flavin (FAD) Kofaktor der Cryptochrome im Grundzustand, der an die sog. Photolyase Homology Region (PHR) Domäne gebunden ist, in seiner vollständig oxidierten Form vorliegt und nach Lichtabsorption in die semireduzierte Form (FADHo) übergeht, die den lit-state dieses Photorezeptors repräsentiert. Hierfür erforderliche Elektron und Proton-Transfer-Wege waren detailliert analysiert. Auch war bekannt, dass Cryptochrome im lit-state durch Photoregulatory Protein Kinases (PPK) phosphoryliert werden und nachfolgend mit zahlreichen Signalkomponenten interagieren, von denen hier exemplarisch nur COP1, SPAs und CIBs genannt sein mögen. Ferner wurde in einer Reihe von Arbeiten gezeigt, dass Cryptochrome nach Lichtanregung oligomerisieren. Die Oligomerisierung ist vermutlich die Voraussetzung für alle oben genannten Prozesse der Signaltransduktion. Weiterhin war bekannt, dass die Inaktivierung der Cryptochrome zumindest zwei Prozesse beinhaltet, nämlich die Übertragung des Elektrons von FADHo auf molekularen Sauerstoff unter Bildung von ROS (Superoxidradikal, Wasserstoffperoxid), sowie die Bindung von Blue Light Inhibitor of Cryptochrome Proteinen (BIC1 und BIC2 in Arabidopsis) an CRY, die die Oligomerisierung verhindern bzw. den Übergang des Oligomers zum Monomer fördern. Die in diesem Projekt durchgeführten Studien mit rekombinanten Proteinen und cryoEM zeigten, dass es sich bei dem CRY1-Oligomer um ein Tetramer handelt. Interessanterweise konnte die Oligomerisierung von CRY1 nicht nur durch Licht, sondern auch durch Wasserstoffperoxid induziert werden. Eine zuvor beschriebene hyperaktive Mutante von CRY1 (cry1L407F) war bereits im Dunkelzustand ein Oligomer. Dies unterstreicht die Aussage, dass CRY nur im oligomeren Zustand biologisch aktiv ist. Wir fanden ferner, dass rekombinantes BIC1 kovalent an einem Cystein (Cys99) Häm bindet. Allerdings war nur ein geringer Anteil des BIC1 mit Häm besetzt. Unabhängig davon postulierten wir zunächst, dass BIC1 möglicherweise als Peroxidase fungiert und das bei der Dunkelreversion von CRY gebildete Wasserstoffperoxid inaktiviert. Diese Vermutung wurde allerdings durch umfängliche, von uns durchgeführte Studien nicht untermauert. Ferner war eine Mutante von BIC1, in der alle Cysteine durch Alanin ersetzt wurden (BIC13CA), nach Überexpression in Arabidopsis Pflanzen biologisch aktiv, was uns vermuten lässt, dass die in vitro beobachtete Häm-Bindung für die biologische Aktivität von BIC1 nicht erforderlich ist.
