Robuste zentrifugal mikrofluidische Miniaturisierung und Automatisierung der Anreicherung von Zielmolekülen für die Identifizierung von Protease Substraten

• Antragsteller: Professor Dr.-Ing. Nils Paust; Professor Dr. Oliver Schilling
• Fachliche Zuordnung: Mikrosysteme
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405351425

Proteine bilden die funktionelle und strukturelle Grundlage lebender Systeme. Proteomik ist die systemweite Analyse von Proteinen; üblicherweise durchgeführt mittels Massenspektrometrie (MS), um tausende von Proteinen in kleinsten Probenmengen zu identifizieren. Moderne Massenspektrometer sind sehr leistungsfähig, jedoch mangelt es der zugehörigen Probenvorbereitung an Robustheit und Reproduzierbarkeit. Dieses Projekt erforscht die zentrifugal mikrofluidische Automatisierung der Probenvorbereitung in der MS-basierten Analyse der Enzym-katalysierten Spaltung von Proteinen in kleinere Fragmente (Proteolyse). Diese Schnittprodukte besitzen eine neue Funktionalität. Fehlregulierte Proteolyse ist ein Kennzeichen zahlreicher Erkrankungen, beispielsweise bei Krebs. Um die Proteolyse zu untersuchen, werden in komplexen Abläufen die Proteintermini markiert und anschließend angereichert. Obwohl diese Ansätze mittlerweile ein integraler Teil vieler Forschungsprojekte sind, bleiben sie sehr arbeitsaufwendig und kranken an mangelnder Robustheit und Reproduzierbarkeit. Diese Nachteile sind ein großes Hindernis bei der Untersuchung krankheits-assoziierter Proteolyse in klinischen Proben; insbesondere da hier häufig nur äußerst begrenztes Probenmaterial zur Verfügung steht. Unser Forschungsprojekt untersucht die zentrifugal mikrofluidische Automatisierung von komplexen proteinchemischen Abläufen mit dem Ziel, eine präzise und robuste Probenvorbereitung bereitzustellen. Mehr als 30 Prozessschritte (chemisches Markieren der endständigen Peptide, Waschschritte, Festphasenextraktion usw.), die zusammen mehr als 100 Grundoperationen (Flüssigkeitstransport, Dosieren, Mischen, usw.) beinhalten, werden auf einer zentrifugal betriebenen Kartusche integriert. Basierend auf unseren Vorarbeiten erwarten wir, dass die Automatisierung mittels zentrifugaler Mikrofluidik einerseits die Konsistenz der gesamten Analysekette signifikant erhöht und andererseits den Probenverbrauch drastisch reduziert. Wir beabsichtigen abschließend, die zentrifugal-mikrofluidische Probenvorbereitung anzuwenden, um die Schlüsselereignisse der Proteolyse im klarzelligen Nierenzellkarzinom anhand wertvoller Patientenproben zu untersuchen. Unsere Forschung wird sich mit der gesamten Systemintegration auseinandersetzen und den Einfluss jedes Automatisierungsschrittes auf die biochemische Leistungsfähigkeit der Analyse bestimmen. Erstmalig wird dabei die folgende Strategie mittels mikrofluidischer Automatisierung untersucht: chemisches Schützen der Zielpeptide eines Proteins, Verdau des Proteins in kleinere Peptide und die Entfernung von mehr als 90 % der ungeschützten Fragmente ("negative Auswahl"), um eine fokussierte Analyse der verbleibenden 10 % (hier: protein-terminale Peptide) durchzuführen. Wir erwarten, dass die vorgeschlagene Forschung einen bedeutenden Einfluss auf beide Felder, die der zentrifugalen Mikrofluidik und die der Proteolyseforschung, haben wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen