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Robuste zentrifugal mikrofluidische Miniaturisierung und Automatisierung der Anreicherung von Zielmolekülen für die Identifizierung von Protease Substraten

Fachliche Zuordnung Mikrosysteme
Förderung Förderung von 2018 bis 2021
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405351425
 
Erstellungsjahr 2022

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Für die Analyse komplexer Proteingemische hat sich die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) als eines der vielseitigsten Instrumente erwiesen, da sie sehr empfindlich ist und Tausende von Proteinen in einer einzigen Messung sowohl identifizieren als auch quantifizieren kann. Die Probenvorbereitung umfasst in der Regel eine spezifische Spaltung der Proteine in Peptide, gefolgt von einer Entsalzung und einer gleichzeitigen Peptidanreicherung, die in der Regel durch Festphasenextraktion erfolgt. Diese Schritte der Probenvorbereitung umfassen zahlreiche Pipettierschritte und sind daher fehleranfällig und arbeitsintensiv. Um die Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung für geringe Proteinmengen zu verbessern, stellen wir einen mikrofluidischen Chip vor, der alle für die Peptidentsalzung durch Festphasenextraktion erforderlichen Schritte automatisiert (DesaltingDisk). Die Evaluation des mikrofluidischen Chips erfolgte durch LC-MS/MS-Analyse tryptischer Peptidmischungen aus eukaryotischen HEK-293-Zellen, die entweder mit dem mikrofluidischen Chip oder in einem manuellen Arbeitsablauf entsalzt wurden. Mit 19775 bzw. 20212 identifizierten Peptiden wurde eine vergleichbare Anzahl von Peptiden in der Disk- und der manuellen Kontrolle identifiziert. Für einen Kernsatz von 10444 Peptiden, die in allen Injektionen quantifiziert werden konnten, wurden die Variationskoeffizienten auf der Grundlage der markierungsfreien Quantifizierungsintensitäten berechnet. Die mit dem Chip prozessierten Proben wiesen mit einem mittleren Variationskoeffizienten von 9,3 % eine geringere Variabilität auf als der mittlere Variationskoeffizient von 12,6 % bei der manuellen Methode. Der vorgestellte zentrifugale mikrofluidische Chip zeigt somit das Potenzial zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit in der Probenvorbereitung für die proteomische Massenspektrometrie. Die Mikrofluidik ermöglicht die Miniaturisierung von biochemischen Analysen. Die geringen Abmessungen verringern den Probenverbrauch und erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeiten. Ein Nachteil ist, dass die hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisse die unspezifische Bindung von Proteinen an das Substratmaterial des mikrofluidischen Chips erhöhen. Der daraus resultierende Probenverlust verringert die Empfindlichkeit und Spezifität von proteinbasierten Assays, insbesondere, wenn geringe Probenmengen analysiert werden. Hier stellen wir eine Hydrophobin-Beschichtung von Mikrofluidik-Chips aus zyklischen Olefin-Copolymeren (COC) vor. Das rekombinante Hydrophobin H*Protein B bildet auf hydrophoben Oberflächen stabile Monoschichten, die diese hydrophil machen und so die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Chipoberflächen und den Proteinen reduzieren. Das Substrat und die Siegelungsschichten des mikrofluidischen Chips wurden im Tauchverfahren beschichtet und anschließend durch Thermodiffusionsbonden zusammengefügt. Die Effizienz der proteinabweisenden Beschichtung wurde durch Verarmungsexperimente in mikrofluidischen Chips bewertet. Bei einer Gesamtproteinmenge von 10 ng wurden Rückgewinnungsraten von 90 % beobachtet, selbst bei mikrofluidischen Kanälen mit einer Länge von bis zu 835 mm. Zum Vergleich: In unbeschichteten mikrofluidischen Kanälen wurden nur 30 % der Proteine zurückgewonnen.

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