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Projekt
Cross-talk und Interaktion der CRISPR/Cas Systeme mit der zellulären regulatorischen Maschinerie in Cyanobakterien
Antragsteller
Professor Dr. Wolfgang R. Hess
Fachliche Zuordnung
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Förderung
Förderung seit 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 405822239
Das Projekt zielt auf die Analyse von CRISPR-Cas Systemen in Cyanobakterien, mit einem Fokus auf ihrer Interaktion mit der regulatorischen Maschinerie des Wirtes. Als Modellorganismus haben wir den unizellulären Stamm Synechocystis sp. PCC 6803 ausgewählt. Dieser Stamm besitzt drei verschiedene CRISPR-Cas Systeme. Zwei wurden als Subtyp I-D bzw. Subtyp III-D charakterisiert. Der dritte repäsentiert einen III-B Varianten (III-Bv) Subtyp, charakterisiert durch ein fusioniertes Cmr6_Cmr1 und ein substituiertes Cmr5 Protein, die mögliche Einbeziehung einer Peptidase und das Fehlen einer assoziierten Cas6 Maturationsendoribonuklease. Bioinformatische Vorhersagen schlagen die Existenz ähnlicher Variantensysteme auch in anderen Prokaryoten vor. Wir konnten zeigen, dass anstelle von Cas6 die Wirts-kodierte Endoribonuklease E als wesentliches Maturationsenzym in das System rekrutiert wurde. Damit stellen sich Fragen zu den beteiligten molekularen und evolutionären Mechanismen. Ein wichtiger Aspekt ist die Suche nach zusätzlichen Wirts- und CRISPR-kodierten Faktoren, die an der Ladung der reifen crRNAs in die CRISPR-Komplexe und an der Reifung der crRNAs am 3’ Ende des Spacers beteiligt sind, sowie die RNase Spezifität und den Typ der von den CRISPR-Cas-Komplexen angegriffenen Nukleinsäure modulieren. Wir möchten diese Fragen untersuchen mithilfe von Pull-down-Assays, der Charakterisierung von Deletionsmutanten entsprechender Kandidatengene in Interferenzassays und in molekularen Analysen, der Erstellung einer RNase E-CRISPR-repeat-RNA Kokristallstruktur und durch die Bestimmung der Struktur des CRISPR3 Holokomplexes. Die Wechselwirkungen zwischen CRISPR-assoziierten RNasen und den Reifungs- und Stabilitäts-bestimmenden Prozessen erscheinen jedoch auch für die beiden anderen, Cas6-abhängigen CRISPR-Cas Systeme komplexer als zunächst angenommen. Deshalb werden wir Wechselwirkungen dieser Cas6 Enzyme mit dem Wirtstranskriptom und die Redoxkontrolle durch das Wirts-kodierte NblS-RpaB Zweikomponentensystem in die Untersuchungen einbeziehen. In beiden Fällen möchten wir die Beteiligung zusätzlicher Enzyme sowie mögliche Konsequenzen für die post-transkriptionelle Regulation der Genexpression verfolgen. Das Projekt wird ergänzt durch die metagenomische Analyse cyanobakterieller Massenentwicklungen, um die Evolution der untersuchten CRISPR-Cas-Systeme, insbesondere hinsichtlich ihrer Architektur, Integration und Interaktion mit dem zellulären regulatorischen Apparat, besser zu verstehen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
