Identifizierung und Charakterisierung von Phosphorylierung in RITA, dem neuen Akteur in der Onkogenese
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die fein abgestimmte räumlich-zeitliche Regulierung der Mikrotubuli-Dynamik ist für verschiedene wichtige zelluläre Aktivitäten wie Mitose und Zellmotilität von entscheidender Bedeutung. Diese Deregulierung führt sehr häufig zu Chromosomeninstabilität, Invasion und Therapieresistenz. Die molekularen Mechanismen sind jedoch nicht vollständig verstanden. RITA, das RBP-J-interagierende und Tubulin-assoziierte Protein, ist ein neues Mikrotubuliassoziiertes Protein. Wir haben berichtet, dass RITA die Dynamik von Mikrotubuli und die Aktivität von Aurora A moduliert. Seine Depletion führt zu schweren Chromosomendefekten bei der Mitose. Bei verschiedenen Tumorentitäten wurde eine Überexpression oder Herunterregulierung von RITA beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass RITA zu einem neuen Akteur in der Onkogenese werden könnte. Daher ist es von größter Bedeutung zu verstehen, wie RITA selbst in Tumorzellen reguliert wird. Um dieses Problem zu untersuchen, wurden verschiedene zelluläre und molekulare Techniken eingesetzt, darunter Gen-Deletion und -Mutation, Kinase-Assay in vitro, in-vivo-Markierung, konfokale Mikroskopie, Immunfluoreszenz Färbung, Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse. Wir zeigen hier, dass RITA in vitro durch mehrere Kinasen phosphoryliert wird, darunter Polo-like Kinase 1 (Plk1), Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) und Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1). Unter mehreren potenziellen Serin- oder Threoninresten phosphoryliert Cdk1 T254 von RITA sowohl in vitro als auch in vivo. Während HeLa CRISPRi RITA T254D-Zellen, in denen RITA stabil abgereichert und vorübergehend mit dem die Phosphorylierung nachahmenden RITA T254D-Konstrukt transfiziert ist, eine defekte Zentralspindel aufweisen, zeigen HeLa CRISPRi RITA T254A-Zellen stabilisierte mitotische Mikrotubuli in der Mitose. Keiner von ihnen ist in der Lage, die durch den Abbau von RITA verursachten mitotischen Defekte vollständig zu beheben. Darüber hinaus macht der Verlust des C-Terminus (aa 157–269), an dem sich T254 befindet, RITA selbst instabil. Die Transfektion dieses Konstrukts induziert einen vergrößerten Bereich der PRC1-Färbung, der mit einer desorganisierten Zentralspindel verbunden ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass RITA fein abgestimmt reguliert werden muss und Cdk1 eine entscheidende Kinase für die Regulierung ist. Hochaktivierte mitotische Kinasen können für die deregulierte RITA verantwortlich sein, was zu einer abnormalen Chromosomenbewegung beiträgt und zu Chromosomeninstabilität führt, einem Kennzeichen bösartiger Zellen. Weitere Studien sind erforderlich, um den Phosphorylierungsstatus von RITA in Tumorgeweben zu untersuchen, ob dieser mit Therapieresistenz zusammenhängt und ob Kinaseinhibitoren die Therapiereaktion in Tumorzellen reaktivieren könnten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells, Obesity and the Tumor Microenvironment of Breast Cancer. Cancers, 14(16), 3908.
Ritter, Andreas; Kreis, Nina-Naomi; Hoock, Samira Catharina; Solbach, Christine; Louwen, Frank & Yuan, Juping
