Untersuchung der Dynamik und Funktion des Transkriptionsfaktors SRF im Zellkern von Nervenzellen anhand von Einzelmolekül-Analyse und hoch-auflösender Mikroskopie

• Antragsteller: Professor Dr. Bernd Knöll; Professor Dr. Jens Michaelis
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 406037611

Die Genexpression im Zellkern wird von Millionen von Molekülen wie z.B. Transkriptionsfaktoren (TFs) beeinflusst. Bisher wurde die gesamte Anzahl von Molekülen eines TFs als homogene Population mit identischen Eigenschaften angesehen. Dagegen zeigen neueste Einzelmolekülanalysen Sub-Populationen, die versch. bio-physikalische Eigenschaften besitzen. In diesem Antrag wollen wir solche modernen Methoden der Einzelmolekül-Analyse verwenden, insbesondere die Methode des Einzelmolekültracking und die Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (Englisch: single molecule lolalisation microscopy, SMLM) mit Lichtblattanregung. Wir benutzen diese Techniken, um den Genregulator SRF (serum response factor) zu untersuchen. SRF erfüllt im Nervensystem wichtige Funktionen wie das Auswachsen von Nervenfasern und die Synapsenbildung. In zahlreichen Erkrankungen, z.B. Verletzungen von Nerven, Neurodegeneration (z.B. M. Alzheimer) oder Epilepsie ist die Funktion von SRF beeinträchtigt, wie Arbeiten an Mäusen zeigen. SRF wird durch synaptische Aktivität angeschaltet und reguliert dann die Transkription von sog. „frühen“ Genen (immediate early genes; IEG) wie c-Fos oder Egr1. Darüberhinaus beeinflusst SRF das Nervenfaserwachstum durch Transkription von Genen, die für das Actin Zytoskelett kodieren.In unserem Antrag untersuchen wir einzelne SRF Moleküle durch ein bereits hergestelltes Fusionsprotein von SRF und der sogenannten Halo Domäne (SRF-Halo). Mit Hilfe dieses SRF-Halo Proteins bestimmen wir zahlreiche Parameter der nukleären SRF Transkriptionsdynamik:i) Die Fraktion der an die DNA gebundenen und nicht-gebundenen Moleküleii) Die absoluten Bindezeiten an die DNAiii) Die SRF Lokalisation in sog. Transkriptions „hot spots“Bisher wurden nur wenige TFs auf Einzelmolekül-Ebene untersucht und die meisten Daten wurden in hoch proliferativen Tumor-Zelllinien erhalten. In unserem Antrag fokussieren wir uns auf primäre aus-differenzierte Nervenzellen aus dem Hippocampus der Maus, die wir mit dem Wachstumsfaktor BDNF („brain derived neurotrophic factor“) stimulieren und lebend untersuchen („live cell imaging“). In einem ersten Schritt werden wir die SRF-Halo Dynamik in Neuronen mit Daten vergleichen, die wir in Vorarbeiten bereits in einer Tumor-Zelllinie (NIH3T3) erhalten haben. Damit können wir feststellen, ob die DNA Bindungseigenschaften von SRF zwischen verschiedenen Zelltypen konserviert sind oder sich unterscheiden. Im nächsten Schritt sehen wir uns an, wie sich die SRF Dynamik während des Reifungsprozesses von Nervenzellen, z.B. beim Aussprossen der ersten Nervenfasern oder der finalen Synapsenbildung, im Zellkern verändert. Zum Schluss untersuchen wir verletzte Nervenzellen, bei denen Nervenfasern - ähnlich wie bei Rückenmarksverletzungen – mit einem gezielten Laserschnitt durchtrennt wurden. Hier wollen wir uns erstmalig auf Einzelmolekül-Ebene ansehen, wie die TF Dynamik während der axonalen Degeneration und anschließenden Regeneration moduliert wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen