Analyse von zellulären Prozessen bei der heterologen Proteinproduktion bei Pseudomonas putida - oder was kostet ein Protein?

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professor Dr.-Ing. Andreas Kremling; Dr. Katharina Pflüger-Grau
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik ; Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 406709163

Pseudomonas putida ist ein wichtiger Mikroorganismus in biotechnologischen Anwendungen, da er einfach handhabbar ist, schnelles Wachstum aufweist und ausreichend resistent gegen metabolen und physiologischen Stress ist. Die Ziel des Antrages ist es, ein ganzheitliches Verständnis der ablaufenden zellulären Vorgänge bei der Herstellung von Fremdprotein durch P. putida zu erhalten. Die Produktion von Fremdprotein führt zu einer Um- und Neuverteilung der zellulären Ressourcen; diese Ressourcen umfassen nicht nur die Prozesse der Transkription (Verfügbarkeit von RNA Polymerase) und der Translation (Verfügbarkeit von Ribosomen), sondern auch die biochemische Energiegewinnung. Um die Umverteilung der Ressourcen leisten zu können und um das Überleben oder sogar weiteres Wachstum der Population zu ermöglichen muss sich der ganze Stoffwechsel anpassen. Gehen dabei notwendige Ressourcen zur Neige erfolgt auch keine Synthese von Fremdprotein mehr, eine Beobachtung, die als Metabolic Burden bezeichnet wird. In diesem Projekt sollen umfangreiche und auf alle zellulären Ebenen ausgerichtete Untersuchungen zur Antwort bei P. putida in Folge einer metabolen Belastung durch die Synthese von Fremdprotein gemacht werden. In einem interdisziplinären Team aus Wissenschaftlern aus Frankreich und Deutschland sollen dazu systematisch Daten mit P. putida erhoben werden. In einem ersten Schritt wird eine Kollektion von Plasmiden konstruiert (Ziel #1), die es erlaubt das System unterschiedlich anzuregen und die gleichzeitig eine Erfassung des metabolen Zustands der Zellen ermöglicht. Zusätzlich sind auch Konstrukte geplant, die die Quantifizierung der RNA Polymerase und der Ribosomen ermöglichen sollen. In einem Screening (Ziel #3) sollen zunächst viele Bedingungen mit den Stammvarianten untersucht werden, um dann anschließend für die interessantesten und vielversprechendsten Bedingungen umfassende Studien zur Bestimmung der intrazellulären Flüsse und des intrazellulären Metaboloms zu machen (Ziel #4). Dazu werden Methoden zur Flussanalyse und zum Metabolom für P. putida angepasst (Ziel #2). Durch die kombinierte Anwendung der entwickelten Methoden wird ein umfassendes Bild der Belastung durch Synthese von Fremdprotein über verschiedene zelluläre Ebenen erhalten. Die aufgenommenen Daten sind Grundlage eines mathematischen Modells welches eine Kostenfunktion ausgeben soll, die den Einfluss der einzelnen Prozesse auch quantitativ darstellen soll (Ziel #5). Zusammenfassend sollen folgende Fragen beantwortet werden: Welche Kosten entstehen auf welcher zellulären Ebene bei der Proteinherstellung? Wo sind die Bottlenecks während der Genexpression? Kann aus den Daten ein prädiktives Modell zur Proteinsynthese abgeleitet werden? Unsere Vision ist die Entwicklung und Bereitstellung einer allgemeinen Toolbox, um den Einfluss der Umgebungsbedingungen und der zellulären Parameter auf die Synthese von Fremdprotein prognostizieren zu können.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Partnerorganisation: Agence Nationale de la Recherche / The French National Research Agency
• Kooperationspartner: Professor Dr. Fabien Létisse