Dissection of the cellular processes during heterologous protein production in Pseudomomas putida – or how much is a protein?
Bioinformatics and Theoretical Biology
Metabolism, Biochemistry and Genetics of Microorganisms
Final Report Abstract
Pseudomonas putida ist ein wichtiger Mikroorganismus in biotechnologischen Anwendungen, da er einfach handhabbar ist, schnelles Wachstum aufweist und ausreichend resistent gegen metabolen und physiologischen Stress ist. Das Ziel des Antrages war es, ein ganzheitliches Verständnis der ablaufenden zellulären Vorgänge bei der Herstellung von Fremdprotein durch P. putida zu erhalten. Die Produktion von Fremdprotein führt zu einer Um- und Neuverteilung der zellulären Ressourcen; diese Ressourcen umfassen nicht nur die Prozesse der Transkription (Verfügbarkeit von RNA-Polymerase) und der Translation (Verfügbarkeit von Ribosomen), sondern auch die biochemische Energiegewinnung. Um die Umverteilung der Ressourcen leisten zu können und um das Überleben oder sogar weiteres Wachstum der Population zu ermöglichen, muss sich der ganze Stoffwechsel anpassen. Gehen dabei notwendige Ressourcen zur Neige erfolgt auch keine Synthese von Fremdprotein mehr, eine Beobachtung, die als ‚metabolische Belastung‘ bezeichnet wird. In diesem Projekt wurden umfangreiche und auf alle zellulären Ebenen ausgerichtete Untersuchungen zur Antwort bei P. putida in Folge einer metabolen Belastung durch die Synthese von Fremdprotein gemacht. Zu Beginn der Arbeit an dem Projekt war es notwendig eine Möglichkeit zu schaffen, die metabolische Belastung einer Zelle messen zu können. Dazu wurde ein Monitoring-System entwickelt, welches aus zwei Modulen besteht, einem zur Generierung der metabolischen Belastung und einem zur Erfassung der zellulären Kapazität. Das Belastungsmodul ist das Plasmid pSEVA438-MBPeGFP, auf welchem das Gen für ein heterologes Protein fusioniert mit dem Gen für eGFP zur leichteren Detektion lokalisiert ist. Als heterologes Protein wurde das Maltose-Bindeprotein aus E. coli gewählt. Die Expression des MalEeGFP Fusionsproteins ist unter der Kontrolle des induzierbaren XylS/Pm Promotors, wodurch die Regulation der Menge des Belastungsproteins ermöglicht wird. Das Kapazitätsmodul ist im Genom von P. putida integriert und besteht aus dem für mCherry kodierenden Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven nicht regulierten Promotors. Mit diesem System konnten wir eine messabre metabolische Belastung zeigen, wenn das Belastungsprotein induziert wurde. Durch Zugabe verschiedener Induktormengen, war es möglich die Belastung zu regulieren. Auslenkungen auf transkriptioneller, sowie auf translationaler Ebene durch Variationen in der Induktorkonzentration, Stabilisierung des mRNA-Transkriptes oder unterschiedlich starke Ribosomenbindestellen war es möglich zu zeigen, dass der Bottelneck der heterologen Proteinproduktion auf translationaler Ebene zu suchen ist. Wir vermuten auf Grund unserer Untersuchungen, dass eine (oder mehrere) der an der Proteintranslation und/oder Produktion beteiligten Ressourcen limitierend werden, so dass die Proteinproduktion nicht mehr gesteigert werden kann, da die Zelle einen Kompromiss zwischen Wachstum und Produktion finden muss. Wir versuchten dies zugunsten der Produktion zu verschieben, indem wir Aminosäuren zufütterten. Überraschenderweise gelang es der Zelle diese hauptsächlich zugunsten des Wachstums einzusetzen. Dies bildet den Startpunkt für ein neues Forschungsprojekt, welches direkt an das hier beschriebene anknüpft und in welchem wir den Einfluss der einzelnen Aminosäuren auf die metabolische Belastung während heterologer Proteinproduktion untersuchen werden.
Publications
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Deciphering the metabolic burden in P. putida during heterologous protein production: Development of a genetic toolbox; Selected oral presentation, 6th joint Conference of DGHM & VAAM, 8.-11. March 2020
Ana Sofia Ortega Arbulu, Hannes Löwe, Karina Hobmeier, Andreas Kremling, Katharina Pflüger-Grau
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Inducing heterologous protein overproduction in P. putida: A genetic toolbox to decipher metabolic burden, Key Note Lecture, 6th European Congress of Applied Biotechnology, 20.-23. September 2021
Ana-Sofia Ortega-Arbulú, Andreas Kremling, Katharina Pflüger-Grau
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Pseudomonas putida and its response to metabolic burden: trade-off between transcription and translation during heterologous protein production; Selected oral presentation Pseudomonas Conference 2022, Atlanta, 19.-23. April 2022
Ana Sofia Ortega Arbulú, Hannes Löwe, Andreas Kremling and Katharina Pflüger-Grau
