Analyse des Netzwerks kotranslational agierender Membran-Targetingfaktoren in E. coli

• Antragsteller: Dr. Günter Kramer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 407215628

Nach gängiger Lehrmeinung existieren in E. coli zwei zentrale Systeme zur Translokation neusynthetisierter Proteine durch die oder in die Zytoplasmamembran. Die „kotranslationale Translokation“ transloziert nahezu ausschließlich Innenmembranproteine (IMPs) und beginnt in einer frühen Phase der Translation durch Ribosomenbindung des „signal recognition particle“ (SRP). Die darauffolgende Membran¬insertion der IMPs erfolgt nach Bindung der Ribosomen ans Translokon in der Membran und wird durch die Synthese des Polypeptids angetrieben. Im Gegensatz dazu werden Proteine der äußeren Membran und des Periplasmas durch die „posttranslationale Translokation“ an ihren Zielort gebracht. Dieser Weg ist unabhängig von Ribosomenbindung an das Translokon und wird durch das an das Translokon gebundene SecA Protein angetrieben. Die Translokation einiger SecA-abhängiger Proteine benötigt darüber hinaus die Funktion des Chaperons SecB. Neuere Ergebnisse aus unserem und anderen Laboren deuten darauf hin, dass einige Aspekte dieser klaren Trennung der beiden Systeme zur Proteintranslokation korrigiert werden müssen: Zum einen konnten wir zeigen, dass SecA an Ribosomen bindet und seine Substrate bereits kotranslational erkennt. Hieraus folgt, dass die klare Unterscheidung zwischen ko- und posttranslationalem Transport nicht richtig ist. Zum Zweiten zeigen unsere neueren Ergebnisse, dass SecA und SecB an Ribosomen binden, die IMPs synthetisieren, und übereinstimmend damit zeigen Daten anderer Labore, dass SecA für die Membran-insertion bestimmter IMPs notwendig ist. Zusammenfassend implizieren diese Ergebnisse einen beträchtlichen Überlapp beider Systeme.Ziel des neu beantragten Projekts ist es, ein umfassenderes Verständnis über die kotranslationale Erkennung naszierender Polypeptide durch das Netzwerk verschiedener Targeting-Faktoren zu erlangen. Dafür werden wir als Erstes das naszierende Interaktom von SecA und SecB bestimmen. Wir werden analysieren, wann während der Proteinsynthese beide Faktoren naszierende Polypeptide binden und untersuchen, welche molekularen Merkmale naszierender Ketten für die Bindung von SecA und SecB verantwortlich sind. Zum Zweiten werden wir die Interaktionsprofile von SRP, SecA, SecB und TF quantitativ miteinander vergleichen und durch weitere SeRP Experimente in Mutanten untersuchen, inwieweit die einzelnen Faktoren als Teile eines gesamten Netzwerks funktionieren. Ziel ist es zu verstehen, wie funktionaler Antagonismus bzw. Kooperation zwischen Faktoren genutzt wird, um maximale Spezifität der Substratselektion zu erreichen. Drittens werden wir untersuchen, ob die Kinetik der Proteinsynthese mit der kotranslationalen Substraterkennung und dem Targeting der Ribosomen an die Membran koordiniert ist.Diese Studie wird unser Verständnis der Proteinsortierung am Ribosom erweitern und aufzeigen, wie das Netzwerk kotranslational agierender Faktoren die effiziente Translokation neusynthetisierter Proteine in E. coli gewährleistet.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen