Lichtregulation der bakteriellen Konjugation durch Phytochrom über Änderung der Protein-Konformation, Protein-Dynamik und Protein Interaktion in Agrobacterium fabrum

• Antragsteller: Dr. Norbert Krauß; Professor Dr. Tilman Lamparter
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie ; Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 409240911

Die beiden Phytochrome Agp1 und Agp2 kontrollieren die Konjugation (DNA-Transfer) im Bodenbakterium Agrobacterium fabrum. Obwohl viel über 3D-Strukturen bakterieller Phytochrome bekannt ist, weiß man wenig über ihre Signaltransduktionswege. Wir wollen die frühen Schritte der Signaltransduktion von Phytochromen zur Konjugation in Agrobacterium fabrum durch Untersuchen möglicher lichtinduzierter Konformationsänderungen von Agp1, Proteinwechselwirkungen zwischen Agrobacterium Phytochromen, Interaktion zwischen Phytochromen und der Relaxase TraA (oder Atu6127), analysieren. Wir wollen verschiedene in-vitro- und in-vivo-Methoden kombinieren, um diese Proteinwechselwirkungen zu untersuchen. Die in-vitro-Wechselwirkung zwischen beiden Phytochromen wurde bereits durch spektrale Veränderungen, Dunkelreversion, Phosphorylierung und "Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer" (FRET) zwischen Phytochromen, die mit fluoreszierenden Atto-Farbstoffen markiert sind, gezeigt. Diese FRET-Studien sollen auf TraA und den Regulator von Agp1, AgRR1, erweitert werden. TraA katalysierte drei Reaktionen: Schneiden eines Einzelstrangs der Plasmid-DNA an der Sequenz von oriT (Übertragungsursprung), Formierung einer kovalenten Bindung mit der DNA und Aufwindung des Doppelstrangs (Helikase). Wir wollen die in-vitro-Assays für alle drei Funktionen etablieren und dann testen, ob Agp1 oder Agp2 eine der Aktivitäten modulieren. Um die Protein-Wechselwirkung in vivo zu untersuchen, wollen wir eine "bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierung" basierend auf "Split YFP" etablieren. Zunächst beginnen wir mit der rekombinanten Expression von Fusionsproteinen und In-vitro-Messungen, dann exprimieren wir Proteinpaare (Agp1, Agp2 oder TraA) jeweils mit der entsprechenden Split-YFP-Markierung in Agrobacterium. So kann man herausfinden, welche Interaktion in vivo stattfindet. Schließlich planen wir, die spezifischen Rollen der drei TraA-Proteine von Agrobacterium bei der Konjugation durch Knockout-Studien aufzuklären.Wir glauben, dass wir ein besseres Verständnis der lichtinduzierten Konformationsänderungen eines Phytochroms sowie einen Einblick in die ersten Schritte der Lichtregulation der Konjugation erlangen werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen