Ortsspezifisches Crosslinking mit KLK-Proteasen aus Prostata

• Antragsteller: Professor Dr. Nediljko Budisa
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 409661645

Viele biologische Prozesse hängen davon ab, dass Proteine an andere Moleküle binden, bei denen es sich oft wieder um Proteine handelt. Manche dieser Komplexe sind sehr stabil und lassen sich strukturbiologisch analysieren. Doch gibt es auch kurzlebige Komplexe, die viel schwerer zu untersuchen sind. Die derzeitigen Verfahren zur Verknüpfung (Crosslinking) der molekularen Komponenten instabiler Komplexe sind eher unspezifisch. Daher ist es wünschens-wert, neue Ansätze zur ortsspezifischen Verknüpfung zu finden.Reaktionen der sogenannten Klick-Chemie führen an definierten Positionen zur Bildung kovalenter Bindungen, darunter die bewährte 1,3-dipolare Cycloaddition, auch bekannt als Azid-Alkin-Klickreaktion, und die für Proteine neu eingeführte Thiol-En-Kopplung. Beide Ansätze beruhen auf nicht-natürlichen Aminosäuren (nnAS), die durch Manipulation des genetischen Codes und der Proteinsynthese von Zellkulturen in ausgewählte Proteine eingebaut werden können. Als Modellsystem für die Wechselwirkung von Proteinen mit Liganden bieten sich menschlichen Gewebekallikreine (Kallikrein-related peptidases, KLKs) aus Prostata an, insbesondere KLK 2, 3, 4, 5, und 11. Diese Serinproteasen haben wichtige physiologische Funktionen bei der Befruchtung, was sich bei Erkrankungen wie Prostatakrebs ändert.Die Kenntnis von einigen KLK-Kristallstrukturen ist eine gute Voraussetzung für den ortsspezifischen Einbau von nnAS an ausgewählten Positionen der Enzyme und deren Verknüpfung mit anderen Molekülen. Dafür werden inaktive KLKs eingesetzt, welche die gebundenen Moleküle nach Klickreaktionen nicht spalten. Die beiden Ansätze der Klick-Reaktionen werden in zwei Schritten angewendet: 1. Inaktive KLK-Varianten mit reaktiven nnAS werden mit Peptiden verknüpft, die als nnAS-Reaktionspartner ein Azid und eine Alkin enthalten, bzw. ein Cystein mit einer olefinischen Seitenkette. Diese Peptide sind von natürlichen Substraten abgeleitet, für welche die Prostata-KLKs spezifisch sind. 2. Die nnAS-KLKs werden mit natürlichen Substraten verknüpft, die mittels rekombinanter Herstellung entsprechend verändert wurden. Nach Reinigung der stabilisierten Komplexe werden diese biochemisch charakterisiert und kristallisiert. Falls für die Röntgenbeugung geeignete Kristalle erhalten werden, können die Strukturen der Komplexe mit großer Wahrscheinlichkeit bestimmt werden.Die ortsspezifische Verknüpfung von Proteinen mit nnAS könnte zu einer allgemeinen Methode für Proteinkomplexe mit anderen Bioolekülen, wie etwa Nukleinsäuren, Lipiden und Zuckern entwickelt werden. Speziell in diesem Projekt können Informationen über die Elemente des Aufbaus der KLK-Proteasen gewonnen werden, die ihre Substratspezifität bestimmen, was bei der Aufklärung biologischer und krankheitsbedingter Vorgänge wie Prostatakrebs sehr wertvoll wäre. Das Wissen über diese „räumliche Spezifität“ der KLK-Proteasen wird die Herstellung neuer Medikamente mit bislang beispielloser Wirksamkeit ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Österreich
• Kooperationspartner: Dr. Peter Göttig, Ph.D.