TRIC: Eine neue Methode zur genomweiten Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von ncRNA:DNA-Triplexen

• Antragsteller: Dr. Holger Bierhoff
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 411482956

Viele nicht-codierende RNAs (ncRNAs) fungieren als epigenetische Regulatoren indem sie die Bindung von Transkriptionsfaktoren und Chromatin-modifizierenden Enzymen an bestimmte Genomabschnitte beeinflussen. Wie ncRNAs ihre Zielregionen finden und mit ihnen wechselwirken ist noch weitgehend unerforscht. Eine Möglichkeit zur sequenzspezifischen DNA-Erkennung sind ncRNA:DNA-Triple Helices (Triplexe), bei denen sich ein Teil der ncRNA in die DNA Doppelhelix unter Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen einlagert. Einige aktuelle Studien weisen auf die Existenz solcher ncRNA:DNA-Triplexe im Menschen und der Maus hin. Bisher konnten aber das Vorkommen und die Funktion dieser Strukturen nur in Einzelfällen und indirekt nachgewiesen werden. Daher habe ich eine als "TRIC" (Triplex recognition in cells) bezeichnete Methode entwickelt, die mit Hilfe des Triplex-Bindeproteins Stm1TBD die Isolierung von ncRNA:DNA-Triplexe aus Zellen ermöglicht. Bei der Etablierung von TRIC habe ich bereits eine ncRNA:DNA Triplex am Kras-Genpromoter in der Maus identifiziert.Ein Ziel des Projekts ist es, mittels TRIC die regulatorische Funktion dieser Kras-Triplex aufzuklären. Hierbei werden auch weitere vorläufige Daten berücksichtigt, die zeigen, dass die Triplex-Bildung mit einer anderen nicht-kanonischen Nukleinsäurestruktur, einer G-Quadruplex, konkurriert. Triplex und G-Quadruplex beeinflussen die Kras-Promotoraktivität gegenläufig durch unterschiedliche Bindung der Transkriptionsfaktoren hnRNP K, Miz1 und Myc. Die Aufklärung des Zusammenspiels von Triplex, G-Quadruplex und den drei Transkriptionsfaktoren wird einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Regulation des Kras-Protoonkogens leisten. Darüber hinaus sind Promotorsequenzen mit dem Potential Triplexe oder alternativ G-Quadruplexe auszubilden bei vielen Protoonkogenen zu finden, so dass der Kras-Promotor wahrscheinlich als Paradigma für einen solchen "Konformationsschalter" dient.Das zweite Ziel des Projekts ist die systematische Identifizierung von ncRNA:DNA Triplexen durch die Kopplung der TRIC-Methode mit Hochdurchsatz-Sequenzierung. In Pilotexperimenten konnte ich durch TRIC mit anschließender RNA-Sequenzierung die Kras-Triplex bestätigen und eine weitere neue ncRNA:DNA Triplex am Rab5c-Genpromotor identifizieren. Im geplanten Projekt soll durch größere RNA-Sequenziertiefe sowie durch zusätzliche DNA-Sequenzierung das Vorkommen von Triplex-formierenden RNA- und DNA-Sequenzen in Mensch- und Mauszellen möglichst vollständig erfasst werden. Anhand der definierten Regel für die Triplex-Basenpaarungen lässt sich dann die genomweite Verteilung von ncRNA:DNA Triplexen bioinformatisch ableiten. Die Ergebnisse werden grundlegend das Verständnis von ncRNA:DNA Triplexen und ihrer Rolle bei der Genregulation ermöglichen und somit einen neuen Impuls für die Erforschung der Verbindung von ncRNAs und Epigenetik geben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen