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Projekt
Mechanismen der präsynaptischen Dysfunktion während akutem metabolischen Stress
Antragsteller
Professor Dr. Jürgen Klingauf
Fachliche Zuordnung
Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
Förderung
Förderung seit 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 394431587
Bis zu 55% des gesamten ATP, dass während der neuronalen Signalübertragung für ein Aktionspotential verbraucht wird, muss für prä- und postsynaptische Prozesse aufgewendet werden. In der ersten Förderperiode haben wir daher systematisch den relativen ATP-Bedarf präsynaptischer Prozesse wie Exozytose, „release site clearance“, Ca2+ clearance, Endozytose sowie Neubildung und Beladung synaptischer Vesikel untersucht. Wir konnten zeigen, dass chemische Inhibition der ATP-Produktion keine unmittelbare Auswirkung auf die Erregbarkeit von Neuronen hat und dass sich eine Erniedrigung der ATP-Konzentration zuerst auf die kompensatorischen Endozytose auswirkt. Überraschenderweise beobachteten wir aber auch, dass eine ATP-Depletion die sofortige Abschaltung des Natrium-Protonen-Antiporters 1 (NHE1-Transporter) bewirkt, was zu einer Blockierung der zytosolischen Re-Alkalinisierung nach voriger stimulationsinduzierter Ansäuerung führt. Da der Phänotyp der langsamen Endozytose nach ATP-Depletion durch pharmakologische Inhibition der NHE1-Funktion nachgeahmt werden konnte, postulieren wir, dass die verlangsamte Endozytose nur eine sekundäre Folge der ATP-Depletion ist und die Inhibierung des NHE1-Transporters der eigentliche primäre Effekt ist, der zu einer ausgeprägten und anhaltenden intrazellulären Ansäuerung führt. Auf diese Weise wird eine Na+-Toxizität durch Blockade des NHE1-vermittelten Na+-Einstroms vermieden, allerdings auf Kosten des intrazellulären pH-Wertes und der akkuraten Vesikel-RezyklierungIn in der zweiten Förderperiode planen wir, die pH-Effekte zu kompensieren um die "echte" ATP-Abhängigkeit der präsynaptischen Exo-/Endozytose zu untersuchen. Zu diesem Zweck werden wir die lichtgetriebene Protonenpumpe Arch3 zusammen mit verschiedenen optischen Reportern präsynaptischer Aktivität einsetzen und die ATP-Abhängigkeit der einzelnen Schritte der präsynaptischen Exo-/Endozytose unter Bedingungen eines stabilisierten zytosolischen pH-Wertes analysieren. Zusätzlich werden wir versuchen, NHE1-Mutanten mit verringerter ATP-Sensitivität zu finden, um eine anhaltende Ansäuerung bei Erniedrigung der ATP-Konzentration zu verhindern. In einem zweiten Teil des Projekts werden wir uns auf die klinische Relevanz von NHE1-Transportern bei Ischämie konzentrieren. Wir werden eine Strömungskammer etablieren, die es erlaubt, ischämische Bedingungen durch reduzierte Sauerstoffzufuhr zu induzieren. Der Grad der ATP-Depletion für verschiedene experimentelle Bedingungen wird mit einem FRET-basierten ATP-Sensor quantifiziert. In Kombination mit optischen Reportern für präsynaptische Aktivität und für zytosolischen pH-Wert werden wir die Auswirkungen von Ischämie und Reperfusion auf die präsynaptische Funktion, den zytosolischen pH-Wert und die NHE1-Aktivität analysieren. Sobald dieser Ansatz etabliert ist, werden wir unser zelluläres Modellsystem auf iPSC-abgeleitete menschliche Neuronen erweitern, die in unserem Labor bereits routinemäßig verwendet werden.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
