Two-pore channels (TPCs): Mechanismen der NAADP-Aktivierung und ihre Funktion für intrazelluläre Transportprozesse

• Antragsteller: Professor Dr. Norbert Klugbauer
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie
• Förderung: Förderung seit 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 415544668

TPC-Kanäle (two-pore channels) bilden eine kleine Familie an Kationenkanälen, die in den Membranen endolysosomaler Kompartimente exprimiert werden. Sie werden mittels des second messenger nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) aktiviert. Allerdings bindet NAADP nicht direkt an die TPCs, sondern an weitere Proteine des Kanalkomplexes. Kürzlich wurden in der Literatur zwei Kandidaten als NAADP-bindende Proteine vorgeschlagen, die in verschiedenen Modellsystemen TPCs aktivierten und einen Ca2+ Strom induzierten. Im Rahmen unseres Projekts wollen wir drei wesentliche Ziele verfolgen:(1) Wir wollen mittels der CRISPR/Cas-Technik zellbasierte genetische Modelle der NAADP-bindenden Proteine etablieren. Mittels intrazellulärer Ca2+-Messungen wollen wir die Mechanismen der NAADP-Aktivierung an den TPCs in ihrer natürlichen Membranumgebung untersuchen. Hierzu werden wir NAADP mittels einer neu etablierten Technik in Liposomen verpacken und somit in MEF-Zellen (WT, TPC1-, TPC2- und TPC1/2-Doppel-KO) einbringen und FURA2 Ca2+-Messungen durchführen. Im Focus dieser Arbeiten sollen Manipulationen (KO, Mutanten, Überexpression) der NAADP-bindenden Proteine und der TPCs und Untersuchungen zu deren zellulärer (Co)-Lokalisation stehen.(2) Während der vorausgegangenen Förderperiode wurden detaillierte RNAseq-Analysen durchgeführt, sie haben uns neue Einblicke in das veränderte Transkriptom TPC-defizienter Zellen geliefert. Zahlreiche Membranrezeptoren waren in ihrer Expression, aber auch in ihren Signalwegen beeinflusst. So wollen wir jetzt zentrale Mechanismen der Endozytose und der intrazellulären Transportprozesse ausgewählter Rezeptoren untersuchen. Wir werden die Konsequenzen der stark reduzierten Expression von Caveolinen in TPC-defizienten Zellen für die Endozytose, für das Rezeptor-„trafficking“ und für die Signalwege aufklären. Markierte Rab-GTPasen in Verbindung mit mikroskopischer live-cell-Beobachtung endolysosomaler Vesikel sollen hier eingesetzt werden.(3) Basierend auf unseren Arbeiten zur Bedeutung von TPC1 für die Freisetzung von Zytokinen aus Makrophagen-Zelllinien sollen in vivo-Modelle zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen etabliert werden. Ein Modell zur Antigen-induzierten Arthritis wurde gerade begonnen und soll weiterverfolgt und ausgebaut werden. Weiterhin soll ein Modell für chronisch entzündliche Darmerkrankungen, der Dextran Sodium Sulfat (DSS) induzierten Colitis etabliert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortliche: Dr. Nina Chevalier; Dr. Bettina Sehnert; Professorin Dr. Regine Süss