Entwicklung hochspezifischer DNS Baseneditoren zur programmierbaren Genom-Editierung

• Antragsteller: Professor Dr. Julian Grünewald
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 416375182

Die Nukleasen der CRISPR-Cas-Familie haben die Forschungsfelder der Genom-Editierung und der synthetischen Biologie revolutioniert. Sie basieren auf einem prokaryotischen Immunsystem zur Abwehr fremder DNA und wurden kürzlich adaptiert um einzelne Basen der DNS von Säugerzellen gezielt editieren zu können. Bei dieser sogenannten Baseneditierung, werden RNS-Führungsmoleküle (guide RNAs) genutzt, um ein Fusionsprotein an eine spezifische DNS-Sequenz zu steuern. Dieses Fusionsprotein (Baseneditor) besteht aus einer katalytisch inaktiven oder nur einen DNS-Strang schneidenden Nuklease der Cas-Familie, sowie einer Deaminase. Der Deaminase wird hierbei durch Cas9 gezielt Einzelstrang-DNS zur Verfügung gestellt, auf welcher Cytidin zu Uracil deaminiert werden kann. Darauffolgende DNS-Reperatur sorgt letztlich für die dauerhafte Transition von Cytidin zu Thymin. CRISPR-Cas-Baseneditoren haben sich in der biomedizinischen Forschung rasch etabliert aufgrund ihrer einfachen Handhabung und der Möglichkeit gezielt und effizient DNS zu editieren ohne dabei Strangbrüche zu induzieren. Ein Hindernis im Hinblick auf die klinische Anwendbarkeit besteht jedoch in der akzidentiellen Editierung von Basen abseits des eigentlichen Zielgens, zumeist Off-Target-Effekte genannt. DNS-Baseneditoren welche C·G zu T·A editieren, beinhalten eine Cytidin-Deaminase der APOBEC-Familie. Diese Off-Target-Effekte sind auf DNS-Ebene bereits ausführlich untersucht worden. Da diese Deaminasen neben DNS jedoch auch einzelsträngige RNS editieren, ist davon auszugehen, dass auch RNS von Off-Target-Effekten betroffen ist. Ob und in welchem Ausmaß diese existieren ist jedoch völlig unbekannt. Eine unspezifisiche Editierung der RNA kann schwerwiegende Nebenwirkungen nach sich ziehen, so wurde dieser Vorgang in Zusammenhang mit Krebs- und Autoimmunerkrankungen beschrieben. Meine vorläufigen Daten zeigen tatsächlich, dass Baseneditoren Off-Target-Effekte auf RNS- Ebene induzieren. Ich schlage daher eine transkriptom- und genomweite Untersuchung mittels Hochdurchsatzsequenzierung vor, um das Ausmaß und den Effekt dieser unerwünschten Editierung von RNS in höchstmöglicher Auflösung zu charakterisieren. Weiterhin möchte ich mithilfe von rationalem Proteindesign Varianten von Baseneditoren entwickeln, welche RNS nicht mehr editieren können, jedoch weiterhin auf DNS-Ebene funktionieren. Darüberhinaus werde ich hochpräzise Baseneditoren generieren, welche sequenzspezifisch DNS editieren und weniger Insertionen oder Deletionen auf DNS-Ebene aufweisen. Diese Experimente werden dazu beitragen das On-Target/Off-Target-Profil von DNS-Baseneditoren eingehend zu charakterisieren. Insbesondere werden die erzielten Ergebnisse Baseneditoren weit sicherer und präziser machen und somit deren Weg zur klinischen Anwendbarkeit ebnen.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Dr. J. Keith Joung, Ph.D.