Strukturbestimmung der kompakten dimeren Konformation von TAp63a und Untersuchung des CK1 abhängigen Aktivierungsmechanismus.

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Dötsch
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 417339402

Die besondere Rolle von Keimbahnzellen als die Quelle aller somatischen und Keimbahnzellen in den folgenden Generationen erfordert besondere Qualitätskontroll-mechanismen. Eizellen werden ausschließlich während der Embryogenese gebildet und weibliche Säugetiere mit einer begrenzten Anzahl von Eizellen geboren. Oozyten werden in der Prophase der Meiose I arretiert, nachdem sie einen Checkpoint durchlaufen haben, der alle Eizellen eliminiert, die nicht die DNA Doppelstrangbrüche repariert haben, die während der homologen Rekombination erzeugt wurden. Dieser Checkpoint bleibt aktiviert und ist verantwortlich für die Eliminierung von Eizellen mit DNA Schäden, z.B. verursacht durch Chemotherapeutika oder Bestrahlung als Teil einer Krebstherapie. Weibliche Krebspatienten werden dadurch oft unfruchtbar und leiden unter einem verfrühten Eintritt in die Wechseljahre. Die Hauptkomponente dieses Oozyten-spezifischen Qualitätskontrollsystems ist TAp63 Alpha, ein Homolog des Tumorsuppressors p53. Wir konnten zeigen, dass TAp63 Alpha in nicht geschädigten Eizellen eine inhibierte, kompakte und nur dimere Konformation annimmt. Die Detektion von DNA Schäden führt über eine Kinase-Kaskade zur Öffnung der inhibierten Struktur und zur Bildung des aktiven Tetramers, wodurch ein pro-apoptotisches Transkriptionsprogram initiiert wird. Wir haben ein bakterielles System für die Expression des geschlossenen dimeren Zustandes optimiert. Basierend auf Mutationsanalyse und SAXS Messungen haben wir ein erstes Modell des inhibierten Zustandes erstellt und gezeigt, dass die C-terminale inhibitorische Domäne zusammen mit der N-terminalen Transaktivierungsdomäne ein sechs-strängiges Beta-Faltblatt bildet, das die Tetramerisierungs-Oberfläche blockiert. Wir wollen jetzt die hoch-aufgelöste Struktur von TAp63 Alpha mittels Cryo Elektronenmikroskopie ermitteln. EM-Aufnahmen von TAp63 Alpha im "negative stain" Modus zeigen eine hohe Qualität und legen nahe, dass die Cryo-EM Struktur von TAp63 Alpha gelöst werden kann. Zusätzlich wollen wir den Mechanismus der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung mittels NMR Spektroskopie untersuchen. Wir konnten bisher zeigen, dass die Aktivierung Phosphorylierungen sowohl durch die Kinase Chk2 als auch die Kinase CK1 benötigt. Phosphorylierung eines einzelnen Serins in einem Loop N-terminal zur inhibitorischen Domäne rekrutiert CK1, welche vier weitere Aminosäuren phosphoryliert. Elektrostatische Abstoßung führt zur Entfaltung des inhibitorischen sechs-strängigen β-Faltblattes. Wir wollen die Aktivierungs- und Phosphorylierungskinetik bestimmen und untersuchen, ob CK1 einen prozessiven oder einen distributiven Modus für die Phosphorylierung verwendet. Wir haben bereits begonnen, die Wechselwirkung von p63 Peptiden mit der Kinase CK1 mittels Röntgenstrukturanalyse eines Komplexes mit einem dreifach-phosphorylierten Peptid zu untersuchen und wollen dies mit verschieden phosphorylierten Peptiden durch Röntgenstrukturanalyse und biophysikalische Methoden erweitern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen