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Phytochrom von Fotochemie zum Signal: MAS-NMR-Studien der Struktur/Funktionsbeziehungen von Cph1 bei atomarer Auflösung

Fachliche Zuordnung Biophysik
Analytische Chemie
Strukturbiologie
Förderung Förderung von 2019 bis 2023
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 417685888
 
Erstellungsjahr 2024

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Phytochrome sind Photorezeptormoleküle, die von allen Pflanzen und vielen Bakterien verwendet werden um ihre Lichtumgebung wahrzunehmen und darauf zu reagieren. Sie verwenden einen Bilin-Cofaktor, um Photonen zu absorbieren und dadurch ihre Absorptionswellenlänge zu verschieben (typischerweise vom roten in den dunkelroten Bereich, also die Zustände Pr und Pfr) und ihr Signal an die Zelle zu de/aktivieren. Unser Ziel war es, mit Hilfe von MAS (magic-angle spinning nuclear) NMR zu untersuchen, wie diese und andere Merkmale mit Änderungen der Molekularstruktur in prokaryotischen Modell-Phytochromen wie Cph1, Cph2-ähnlichen Phytochromen und verschiedenen Cyanobacteriochromen (CBCRs) zusammenhängen. Außerdem konnten wir neue Techniken entwickeln, die sich bei der MAS-NMR und anderen Methoden als allgemein nützlich erweisen könnten. Wir weisen darauf hin, dass unsere Arbeit durch die Covid-Pandemie 03.2020-12.2021 drastisch eingeschränkt wurde. Ein großes colaboratives Projekt konzentrierte sich auf die bemerkenswerte Y176H-Mutante von Cph1. Diese Variante ist nicht nur stark fluoreszierend, sondern sendet in pflanzlichen Phytochromen auch bei völliger Dunkelheit Signale an die Zelle. Es gelang uns, die Cph1-Mutante zu kristallisieren, und es zeigte sich, dass das Chromophor zwar in der Pr-typischen Konformation vorlag, das Protein jedoch typische Eigenschaften von Pfr aufwies. Wir untersuchten diese bemerkenswerte Entkopplung von Chromophor und Protein eingehend und identifizierten einen sehr langlebigen angeregten Zustand, der nicht in der Lage ist, den Übergang zu Pfr zu vollziehen, als Ursache für die starke Fluoreszenz. Außerdem wollten wir das intramolekulare Signal untersuchen, das das Chromophor mit einem Teil des Moleküls - der Zunge - verbindet, von dem bekannt ist, dass es bei Lichtaktivierung radikal umfaltet. Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit der Oschkinat-Gruppe in Berlin an Wildtyp-Cph1 durchgeführt, wodurch die DNP-Verstärkung des MAS-NMR-Signals genutzt werden konnte. Dabei traten zahlreiche technische Probleme auf, so dass auch jetzt nur ein Teil des geplanten Programms abgeschlossen werden konnte. Außerdem waren wir überrascht, dass die erwarteten Signale für den Pfr-, nicht aber für den Pr-Zustand aufgelöst werden konnten. Wir untersuchten auch ultraschnelle Veränderungen in Cph1 während der Rückkonversion von Pfr zu Pr. Wir fanden heraus, dass die Dynamik im Protein gleichzeitig mit der Isomerisierung des Chromophors beginnt. Die ultra-schnelle Reaktion des Proteins wird möglicherweise von elektrostatischen Kräften ausgelöst. CBCR-GAF-Domänen sind kleine Biliproteine, die bemerkenswert verschiedene Variationen der Absorptionswellenlänge aufweisen. Wir haben uns auf einen Typ konzentriert, bei dem ein rotabsorbierender Dunkelzustand ähnlich dem Pr der kanonischen Phytochrome ein hypsochrom verschobenes, grünabsorbierendes Photoprodukt bildet. MAS-NMR- und QM/MM-Berechnungen gaben Aufschluss über Veränderungen in und um das Chromophor und die Rolle eines konservierten Tyrosins bei der spektralen Abstimmung. Unabhängig davon konnten wir zeigen, dass dieses Tyrosin bei der Pr→Pfr-Photokonversion eine wichtige Rolle spielt, was eine Grundlage für das rationale Design optimierter Phytochrome für biotechnologische Anwendungen darstellt. Die thermische Reversion von Photoprodukten ist ein Problem bei der Untersuchung kurzlebiger Photoprodukte. Daher haben wir einen innovativen Ansatz zur Stabilisierung von Photoprodukten entwickelt, indem wir das Protein in Trehalosegläser (TGs) einbauen. Wir konnten zeigen, dass die TGs die thermische Reversion der inkorporierten Proteine über Wochen hinweg bei Raumtemperatur verhindern und dabei die strukturelle und funktionelle Integrität der Proteine bewahren. Selbst mit DNP-Verstärkung ist MAS NMR eine unempfindliche Methode, die große Probenmengen erfordert, während die Proben selbst in Rotoren mit extrem hohen Geschwindigkeiten gedreht werden müssen, was die mögliche Größe des Rotors einschränkt. Daher haben wir Ultrazentrifugationstechniken entwickelt, die es ermöglichen, Proteine im Probenrotor zu konzentrieren.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

 
 

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