Nicht-kanonische mtDNA-Spezies bei mitochondrialen Funktionsstörungen und oxidativer Schädigung

• Antragsteller: Professor Dr. Wolfram S. Kunz; Dr. Gábor Zsurka
• Fachliche Zuordnung: Molekulare und zelluläre Neurologie und Neuropathologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 418086619

Im gegenwärtig laufenden DFG-geförderten Projekt ‘Mechanismen der Entstehung von mitochondrialen DNA-Deletionen – Die Rolle der linearen mtDNA‘ ist es uns gelungen, die molekularen Komponenten der Degradationsmaschinerie von mitochondrialer DNA (mtDNA) zu identifizieren. Dieses sind bekannte Komponenten der mitochondrialen Replikationsmaschinerie: die mitochondriale 5‘-3‘-Exonuclease MGME1, die 3‘-5‘-Exonuclease-Aktivität der mitochondrial DNA-Polymerase POLG und die mitochondrial DNA-Helicase TWNK. Unsere neuesten experimentellen Daten zeigen, dass eine genetische Inaktivierung dieser Komponenten des mtDNA-Degradationskomplexes zu einer substantiellen Akkumulation von nicht-kanonischen mtDNA-Molekülen führt, welche als Intermediate der mtDNA-Replikation oder von mtDNA-Schädigungsprozessen normalerweise sehr schnell degradiert werden. Da die Struktur dieser Moleküle gegenwärtig noch unbekannt ist, planen wir in dem vorliegenden Projektantrag moderne, ultra-tiefe DNA-Sequenziertechniken an hochreiner mtDNA anzuwenden, um deren Struktur aufzuklären. Um eine schnelle Degradation dieser nur in geringen Mengen vorkommenden Moleküle zu vermeiden, werden wir uns auf die Untersuchung von hochreiner mtDNA von verschiedenen Modellen mit genetisch inaktivierter mtDNA Degradation fokussieren (HEK-293-Zellen mit MGME1 knockout, HEK-293-Zellen mit POLG p.D274A knockin, Mäuse mit POLG p.D257A knockin und Fibroblasten von Patienten mit MGME1 knockout). Für die umfassende molekulare Charakterisierung von nicht-kanonischen mtDNA Molekülen planen wir die ultra-tiefe Sequenzierung von Linker-ligierter mtDNA nach verschiedener Vorbehandlung (unbehandelt, T4-Polymerase, S1-Nuclease, T7-Endonuclease-I) zur Charakterisierung der freien DNA-Enden mit einer ‚long-read‘ PacBio-Sequenzierung zu kombinieren, um die Struktur des Gesamtmoleküls aufzuklären. Zusätzlich dazu planen wir, die Auswirkungen von oxidativen und replikativen Stress auf die Bildung von nicht-kanonischer mtDNA zu untersuchen. Das Wissen über die Struktur und die Bildung von nicht-kanonischen mtDNA Molekülen ist essentiell für ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der mtDNA Replikation. Zusätzlich dazu werden unsere Daten die Prozesse von Schädigung und Reparatur von mtDNA besser beleuchten, was für das Verständnis der Mechanismen der mtDNA-Mutagenese relevant ist.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen