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Projekt
Molekulare Mechanismen und funktionelle Implikationen der Ded1p- Phasentrennung.
Antragsteller
Professor Dr. Remco Sprangers
Fachliche Zuordnung
Strukturbiologie
Förderung
Förderung seit 2019
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 418960343
Ded1p (DDX3) ist eine RNA-DEAD-Box Helikase, die Sekundärstrukturelemente in der 5’-UTR (Untranslatierte Region) einer mRNA entfernt. Dies erleichtert das Scannen der ribosomalen 40S-Untereinheit und die Identifizierung des Translationsinitiationscodons. Bei zellulärem Stress wird Ded1p zu zytoplasmatischen Stressgranula rekrutiert, die mRNPs enthalten deren Translation blockiert ist. Funktionell schützt die Bildung von Stressgranula die eingebettete mRNAs vor Abbau und induziert Veränderungen in der Genexpression, so dass die Stressreaktion hochreguliert wird.Hier befassen wir uns mit den molekularen Details der Wechselwirkungen, die für die Ded1p-Kondensation in Stressgranula verantwortlich sind. Darüber hinaus untersuchen wir, wie die Ded1p-Aktivität durch diesen Kondensationsprozess moduliert und reguliert wird.Experimentell werden wir biochemische Methoden anwenden, um zu bestimmen, welche Ded1p-Aminosäuren zur LLPS (liquid-liquid phase separation) des Enzyms beitragen. Basierend auf biophysikalischen Studien, insbesondere der NMR-Spektroskopie, werden wir aufdecken, welche transienten intermolekularen Kontakte bei der Kondensation stattfinden und wie die Dynamik des Proteins durch diese Wechselwirkungen beeinflusst wird. Diese Daten werden mit Molekulardynamik-Simulationen kombiniert, sodass wir letztendlich das LLPS-Verhalten vorhersagen können. Um zu untersuchen, wie die Aktivität der Ded1p-Helikase durch LLPS moduliert wird, werden wir die Turnover-Raten von minimal mutierten Ded1p-Proteinen bestimmen, die veränderte Kondensationsverhalten aufweisen. Basierend auf einer großen Anzahl dieser Mutationen zielen wir darauf ab, eine direkte Korrelation zwischen Aktivität und Phasentrennung herzustellen. Diese strukturellen und katalytischen Studien werden durch Experimente in Gegenwart von (capped) RNA und Komponenten des cap-Bindungskomplexes ergänzt. Insgesamt werden unsere Daten damit zum Verständnis beitragen, wie die Ded1p-Aktivität durch die Bildung von Stressgranula reguliert wird. Unsere in-vitro-Einblicke bezüglich Ded1p-Kondensation, -Wechselwirkungen und -Aktivität werden mit in vivo Experimenten ergänzt, die die zelluläre Relevanz unserer in vitro gewonnenen Erkenntnisse sicherstellen.Zusammenfassend wird unsere Arbeit mechanistische Einblicke in die atomaren Details liefern, die zu Ded1p LLPS führen und wie letzteres sich auf die katalytische Aktivität und die Zellfunktion auswirkt. Darüber hinaus werden unsere Ergebnisse das allgemeine Verständnis der molekularen Grundlagen von LLPS verbessern.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
