Prgrammierbare 5-Methylcytosine-Oxidation und Kovalente Isolation von Genomischen Loci für die gezielte Proteom-Analyse

• Antragsteller: Professor Dr. Daniel Summerer
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 418983006

Genexpression in Säugern wird durch 5-Methylcytosin (mC) dynamisch reguliert. mC wird durch DNA-Methyltransferasen eingeführt, während die iterative Oxidation von mC zu 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), 5-Formylcytosin (fC) und 5-Carboxycytosin (caC) durch TET-Dioxygenasen die aktive Demethylierung einleitet. Oxidierte mC-Derivate (oxi-mC) sind potentielle epigenetische Marker mit einzigartigen Interaktionsfähigkeiten für Chromatinproteine. Fishing/Proteomik-Studien mit synthetischen DNAs in Kernextrakten lieferten erste Interaktionsprofile von oxi-mC. Obwohl diese wertvolle erste Hinweise auf die Funktionen der Basen liefern, spiegeln sie nicht die komplexen Interaktionsnetzwerke in Chromatin wider und können keine Kausalitäten zwischen der de novo mC-Oxidation und Änderungen in der Chromatin-Landschaft an gewählten Loci in vivo aufzeigen, wie etwa der Proteinzusammensetzung und -modifikation. Wir werden Werkzeuge für die intrazelluläre mC-Oxidation an gewählten genomischen Loci in Kombination mit der kovalenten Isolierung dieser Loci für Proteomik-Studien entwickeln. Dies wird 1.) die Entdeckung von Proteinen ermöglichen, die direkt oder indirekt rekrutiert oder abgestoßen werden, und 2.) aufdecken, welche Histon- und andere Proteinmodifikationen durch mC-Oxidation geschrieben oder gelöscht werden können. Wir werden Fusionskonstrukte von TET-Enzymen und TALE-Effektoren (TALEs) entwerfen und diese in Säugerzellinien exprimieren. Wir werden diese Konstrukte mit Cyclooctin-Funktionen für spannungsvermittelte inverse Elektron-Diels-Alder-Cycloaddionen (SPIEDAC) ausstatten. Nach Locus-spezifischer Bindung und mC-Oxidation, Formaldehydvernetzung sowie DNA-Isolierung und Fragmentierung, ermöglicht SPIEDAC mit Tetrazin-funktionalisierten Beads die vollständig kovalente Isolierung der gebundenen Chromatinloci. Der kovalente Einfang durch SPIEDAC sollte die Limitationen nichtkovalenter Einfangansätze im Hinblick auf Sensitivität, Selektivität und Fähigkeit zur stringenten Entfernung von Falsch-Positiven Proteinen überwinden. Wir werden diesen Ansatz zunächst auf den repetitiven SATIII-Locus anwenden, der an der Bildung von Stresskörpern nach Hitzeschocks beteiligt ist, um den epigenetischen Kontrollmechanismus dieses Prozesses zu untersuchen. Danach werden wir die drei Einzel- Genorte CDKN2A, BRCA1 und ZAP70 untersuchen, die an der mC-kontrollierten Krebsentstehung in verschiedenen Zelltypen beteiligt sind und verschiedene Promotortypen in Bezug auf CpG-Dichten abdecken. Aus diesen Studien erwarten wir neue Erkenntnisse darüber, wie oxi-mC an der regulatorischen, direkten und indirekten Proteinrekrutierung und -freisetzung beteiligt sind und wie sie in das Crosstalk zwischen DNA- und Protein-(Histon)-modifikationen eingebettet sind. Unser Ansatz bietet einen neuen Weg zur Entdeckung von Readern von oxi-mC durch die Identifizierung solcher Wechselwirkungen in natürlichem Chromatin und in verschiedenen Locus- und Zellkontexten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen