Prgrammierbare 5-Methylcytosine-Oxidation und Kovalente Isolation von Genomischen Loci für die gezielte Proteom-Analyse
Biologische und Biomimetische Chemie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
5-Methylcytosin (mC) ist ein dynamisches Regulationselement des Säugergenoms, das die Genexpression während der Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und Krebsentstehtung reguliert. mC wird durch DNA-Methyltransferasen (DNMT) in Genome eingeführt, während die iterative Oxidation von mC zu 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), 5-Formylcytosin (fC) und 5-Carboxycytosin (caC) durch TET-Dioxygenasen die aktive Demethylierung einleitet. Oxidierte mC-Derivate (oxi-mC) sind potentielle epigenetische Marker mit einzigartigen Interaktionsfähigkeiten für Chromatinproteine. Fishing/Proteomik-Studien mit synthetischen DNAs in Kernextrakten lieferten erste Interaktionsprofile von oxi-mC. Obwohl diese Studien wertvolle erste Hinweise auf die Funktionen der Basenmodifikationen liefern, spiegeln sie nicht die komplexen Interaktionsnetzwerke in Chromatin wider und können keine Kausalitäten zwischen der de novo mC-Oxidation und Änderungen in der Chromatin-Landschaft an gewählten Loci in vivo aufzeigen, wie etwa der Proteinzusammensetzung und -modifikation. In diesem Projekt wurden Werkzeuge für die Anreicherung gewählter genomischer Loci aus Zellen für Proteomik-Studien entwickelt, die in einfacher Weise mit der in situ Einführung von Basenmodifikationen kombiniert werden können. Es wurden TALE-Effektoren (TALEs) entworfen und in Säugerzellinien exprimiert. Diese Konstrukte wurden mit unnatürlichen Aminosäuren (UAA) ausgestattet, die spannungsvermittelte inverse Elektron-Diels-Alder-Cycloaddionen (SPIEDAC) ermöglichen. Nach Locus-spezifischer Bindung des TALEs in vivo, Formaldehydvernetzung sowie DNA-Isolierung und Fragmentierung ermöglicht SPIEDAC mit Tetrazin-Biotin-Konjugaten eine Isolierung der gebundenen Chromatinloci durch Streptavidin-konjugierte magnetische Festphasen. Es wurden TALES für die Bindung des repetitiven SATIII-Locus entworfen, der an der Bildung von Stresskörperchen nach Hitzeschocks beteiligt ist. Isolierung und MS/MS Studien boten neue Einsichten in die lokalen Änderungen des Proteoms. Die etablierte Methode bildet eine vielversprechende Basis zur Untersuchung von lokalen Proteomveränderungen durch Basenmodifikationen, etwa durch Fusion der TALE-Proteine mit DNMT- oder TET-Domänen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Encoded, click-reactive DNA-binding domains for programmable capture of specific chromatin segments. Chemical Science, 11(46), 12506-12511.
Witte, Anna; Muñoz-López, Álvaro; Metz, Malte; Schweiger, Michal R.; Janning, Petra & Summerer, Daniel
