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Projekt
Studien der Kernporen ähnlichen Permeabilitäts-Eigenschaften von phasenseparierten, flüssigen FG Nucleoporin Kondensaten
Fachliche Zuordnung
Biophysik
Biochemie
Biochemie
Förderung
Förderung seit 2019
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 419070619
Die nukleäre Kernpore (NPC) durchdringt die nukleare Hülle und kontrolliert den nukleoplasmischen Transport. Die Permeabilitätsbarriere des NPCs besteht aus etwa zehn verschiedenen “FG-Nups“, deren ungeordneter Strukturanteil reich an Phenylalanin (F) Glycin (G) ist. Dieser FG-Abschnitt interagiert nicht kovalent zu einer supramolekularen Matrix im zentralen Teil des NPCs, dessen struktureller Aufbau weiterhin unbekannt ist. Wir haben einen Mikrofluidik Chip entwickelt, der uns erlaubt kinetische Prozesse der FG-Nup Assemblierung via liquid-liquid phase separation (LLPS) zeitlich aufzulösen. Wir haben bereits gezeigt, dass FG-Nups nach der Phasenseparation zeitweise einen „liquid-like Droplet state“ annehmen können, welcher sich in wenigen Minuten weiter in einen „solid-like state“ entwickelt. Auch wenn der liquid state nur kurzweilig ist, die Nutzung von aufeinanderfolgenden mikrofluidische Mixern erlaubt uns die Eigenschaften der Permeabilitätsbarriere unmittelbar nach Dropletbildung mit einer Zeitauflösung, welche unter normalen Laborbedingungen unmöglich wären, zu untersuchen. Durch die Nutzung des Chips haben wir herausgefunden, dass der liquid state überraschenderweise die Hauptmerkmale der natürlichen Permeabilitätsbarriere wiedergibt, große Cargos (>4 nm) benötigen die Bildung eines NTR:Cargo Komplexes um in die Droplets einzudringen (Celetti et al., JCB 2019). Um herauszufinden, wie diese Permeabilitätsbarriere arbeitet und die Bildung supramolekularer Strukturen, ebenso wie die mechanischen Eigenschaften der FG reichen Droplets zu untersuchen, planen wir die Entwicklung einer „multi-analytischen“ Plattform, welche Mikrofluidik mit nichtlinearer Raman-Spektroskopie (CARS) und Einzelpartikel verfolgende Mikrorheologie (PTM) kombiniert (Chatterjee et al., Adv. Sci. 2021). Zeitgleich haben wir ein multikomponentes “Sticker“ und “Spacer“ Model entwickelt, das uns einen theoretischen Rahmen zur Verfügung stellt, um komplexe Phaseneigenschaften von Lösungen mit multivalenten Biopolymeren mit spezifischen interagierenden Seiten, wie FG-Nups, vorherzusagen (Michels et al., Biomacromolecules 2021). Zusammen werden beide Verfahren ein schlüssiges Bild abgeben, um zu erklären, wie das Gleichgewicht zwischen homo- und heterotypischen Interaktionen in FG/FG/NTR Gemischen die Phaseneigenschaften modulieren und wie sich dies zu den Eigenschaften der Permeabilitätsbarriere von kondensierten liquid state verhält. Wir vermuten, dass die Barriereeigenschaften vom NPC durch NTRs und FG-Nup-Heterogenität verändert werden und dadurch ein dynamisches Modulieren der NPC-Permeabilität in Zellen ermöglichen. Schlussendlich ist die von uns entwickelte Plattform eine allgemeine Methode zur Untersuchung von LLPS von phasenseparierenden Proteinen, insbesondere jener, die sich schnell zu gel- oder amyloidähnlichen Strukturen entwickeln, wie z.B. FUS, Tau und α-synuclein oder andere Proteine assoziiert mit Neurodegeneration.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
