Molekulare Charakterisierung von Hunk, ein neuer Regulator der pankreatischen β-Zellfunktion

• Antragstellerin: Dr. Tanja Schallschmidt
• Fachliche Zuordnung: Endokrinologie, Diabetologie, Metabolismus
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 419280124

Das vorliegende Forschungsprojekt handelt von der molekularen Charakterisierung des Gens Hunk, welches kürzlich mittels "quantitative trait locus" (QTL) Analyse im Attie-Labor identifiziert, und für welches eine inhibierende Wirkung auf die Insulinsekretion in murinen isolierten Inselzellen des Pankreas gezeigt werden konnte. Hunk ist eine Serin / Threonin-Proteinkinase, deren direkte Substrate nicht bekannt sind. Die Identifizierung dieser Substrate ist jedoch notwendig, um den zugrundeliegenden Mechanismus zu verstehen, durch den die Proteinkinase die Insulinsekretion reguliert. Um potenzielle Substrate von Hunk zu identifizieren, wurde im Vorfeld bereits eine Phosphoproteom-Analyse an Inselzellen von Hunk-Wildtyp und Hunk-Knockout Mäusen durchgeführt. Diese Analyse identifizierte 243 Proteine, die differenziell zwischen den beiden Genotypen phosphoryliert waren, wobei die stärkste Phosphorylierungsänderung für das Gen Pard3b ermittelt wurde. Interessanterweise wurde der humane PARD3B Genlocus bereits mit einem erhöhten Typ 2-Diabetes (T2D)-Risiko in mexikanischen Populationen in Verbindung gebracht. Allerdings konnte mit Hilfe der Phosphoproteom-Analyse nicht zwischen direkten Substraten, sowie Substraten, die indirekt infolge des Hunk-Knockouts verändert sein könnten, unterschieden werden. Daher besteht das primäre Forschungsziel dieses Projektes in der Identifizierung der direkten Substrate für Hunk. Um diese zu identifizieren, ist ein chemisch-genetischer Ansatz geplant, der bereits erfolgreich zur Identifizierung der physiologischen Substrate mehrerer anderer Proteinkinasen eingesetzt wurde. Die Methode erfordert zunächst die Erzeugung einer sogenannten analog-sensitiven (AS) Kinase, die in der Lage ist, ATP-Analoga zu binden. Daher besteht die erste Aufgabe in der Generierung einer AS-Hunk-Kinase. Anschließend soll das generierte Konstrukt in einem in-vitro Kinase-Assay eingesetzt werden, in dem ATP-Analoga verwendet werden, die ausschließlich von der AS-Hunk-Kinase gebunden werden können und somit die Detektion Hunk-spezifischer Phosphorylierung ermöglicht. Anschließend sollen die phosphorylierten Substrate aus den Inselzellen der Hunk-Knockout Mäuse, sowie aus menschlichen Inselzellen isoliert, aufgereinigt und die Proteine über Massenspektroskopie in Kooperation mit Professor Lloyd Smith an der Universität von Wisconsin identifiziert werden. Zuletzt soll durch die Erzeugung spezifischer Mutationen an den jeweiligen Phosphorylierungsstellen der identifizierten Substrate, die entweder den phosphorylierten- oder den unphosphorylierten Zustand imitieren, die mögliche Auswirkungen der phosphorylierten Proteine in funktionellen in-vitro Assays untersucht werden.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Alan D. Attie, Ph.D.