Expressionsprofil und neue Ziel-mRNAs der kleinen nicht-kodierenden RNA MarS in Streptococcus pyogenes: eine Transkriptomstudie

• Antragstellerin: Privatdozentin Nadja Patenge, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 420051101

Streptococcus pyogenes ist für eine hohe globale Krankheitslast mit großer Bandbreite klinischer Manifestationen verantwortlich. Der Erfolg einer S. pyogenes Infektion hängt von einem umfangreichen Repertoire strikt regulierter Virulenzfaktoren ab. Kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) gehören zu den regulatorischen Molekülen, die an der Kontrolle der Virulenzfaktor-Genexpression in pathogenen Bakterien beteiligt sind. In Vorarbeiten zu diesem Antrag haben wir die trans-kodierte sRNA MarS identifiziert, die die Expression des Gens für den zentralen Transkriptionsaktivator Mga in S. pyogenes moduliert. In Abwesenheit von MarS waren sowohl die Adhärenz von S. pyogenes an humane Keratinozyten als auch das Überleben in humanem Vollblut reduziert. Die Reduktion von Adhärenz-vermittelnden Virulenzfaktoren in der marS Deletionsmutante führte zu einer erhöhten Dissemination im Maus-Infektionsmodell. Typischer Weise sind trans-kodierte sRNAs in der Lage mehrere Ziel-mRNAs zu binden. In diesem Projekt soll das MarS-Regulon untersucht werden, indem weitere Target-mRNAs identifiziert werden und der molekulare Regulationsmechanismus aufgeklärt wird. Um diese Ziele zu erreichen, gehen wir in zwei Schritten vor. Zunächst wird untersucht, unter welchen Bedingungen marS in S. pyogenes exprimiert wird. Drei verschiedene Serotypen, die für drei der diversen Krankheitsverläufe repräsentativ sind, sollen für diesen Ansatz eingesetzt werden: M1T1 (MGAS5005), M18 (MGAS8232) und M49 (591). Die Bakterien werden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert und in verschiedenen Wachstumsphasen und nach Exposition mit infektionsrelevantem Stress geerntet. Die Serotyp-spezifischen Transkriptome unter den unterschiedlichen Bedingungen werden mit Hilfe von RNAseq analysiert. Mit diesem Ansatz kann das das Expressionsprofil von marS in den drei Stämmen ermittelt werden. Zusätzlich wird pro Stamm ein RNA-Pool aus den Proben aller Bedingungen untersucht, um die Transkriptom-Organisation zu analysieren und zu vergleichen. Die Daten aus diesem Schritt liefern Informationen über genomweite Transkriptionsstarts, die Operonstruktur, Antisense-Transkription und über neue sRNA-Kandidatengene. Im zweiten Schritt sollen MarS Ziel-mRNAs durch einen Vergleich der Wildtypstämme mit ihren isogenen marS Deletionsmutanten identifiziert werden. Die Bakterien werden unter den Bedingungen kultiviert, die die Expression von marS induzieren. RNAseq wird eingesetzt, um differentiell exprimierte Gene zu detektieren, die potentielle Targets darstellen. Target-Prediction Algorithmen (IntaRNA, CopraRNA) werden angewendet, um die direkte Interaktion von MarS mit potentiellen Ziel-mRNAs zu untersuchen. Die vorhergesagten Sequenzen werden verwendet, um Sonden für sRNA-mRNA Gel-Shift Experimente zu konstruieren. Die physiologische Relevanz der putativen Targets wird im Anschluss durch in vitro Virulenzassays verifiziert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen