Expressionsprofil und neue Ziel-mRNAs der kleinen nicht-kodierenden RNA MarS in Streptococcus pyogenes: eine Transkriptomstudie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Streptococcus pyogenes ist für eine hohe globale Krankheitslast mit großer Bandbreite klinischer Manifestationen verantwortlich. Der Erfolg einer S. pyogenes Infektion hängt von einem umfangreichen Repertoire strikt regulierter Virulenzfaktoren ab. Kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) gehören zu den regulatorischen Molekülen, die an der Kontrolle der Virulenzfaktor-Genexpression in pathogenen Bakterien beteiligt sind. In Vorarbeiten zu diesem Antrag haben wir die trans-kodierte sRNA MarS identifiziert, die die Expression des Gens für den zentralen Transkriptionsaktivator Mga in S. pyogenes moduliert, die Adhärenz von S. pyogenes an humane Wirtszellen, das Überleben in humanem Vollblut und die Dissemination im Maus-Infektionsmodell beeinflusst. In diesem Projekt wurde die marS-Expression untersucht, um weitere Target-mRNAs zu identifizieren. Dazu wurden zunächst Bedingungen ermittelt unter denen marS in S. pyogenes exprimiert wurde. Drei verschiedene Serotypen, die für drei der diversen Krankheitsverläufe repräsentativ sind, wurden für diesen Ansatz eingesetzt: M3 (MGAS315), M18 (MGAS8232) und M49 (591). Die Bakterien wurden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert und in verschiedenen Wachstumsphasen und nach Exposition mit infektionsrelevantem Stress geerntet. Die Serotyp-spezifischen Expressionsprofile von marS unter den unterschiedlichen Bedingungen wurde mit Hilfe von reverser Transkription und anschließender quantitativer PCR aufgenommen. Während die marS-Expression über die Wachstumsphasen hinweg konstant blieb, war sie in der späten stationären Phase, unter Glukosemangel, pH-Stress und oxidativem Stress reduziert. Eine erhöhte marS-Expression wurde unter Temperaturstress beobachtet. Zusätzlich wurde pro Stamm ein RNA-Pool aus den Proben aller Bedingungen mit Hilfe von RNAseq untersucht, um die Transkriptom-Organisation der Stämme zu analysieren und zu vergleichen. Es wurden genomweite Transkriptionsstarts, Operonstrukturen, Antisense-Transkription, Phagenregionen und sRNA-Gene identifiziert. Die Information aus den Transkriptomdaten wurde zur Herstellung isogener marS Deletionsmutanten/Komplementanten in den drei Stämmen genutzt. Für die Komplementation wurde marS in stille Regionen des Genoms unter Kontrolle des eigenen Promotors integriert, um eine Überproduktion der kleinen RNA zu vermeiden, die in der Vergangenheit zu hoher Variabilität der Daten geführt hatte. Für alle drei Stämme liegen nun Deletionsmutanten vor sowie Komplementanten, die Wildtyp-Expressionslevel von marS aufweisen und zur Identifikation von MarS Ziel-mRNAs und für funktionelle Untersuchungen verwendet werden können. Die Bakterien wurden unter den Bedingungen kultiviert, die die Expression von marS beeinflussen und RNAseq wurde eingesetzt, um differentiell exprimierte Gene zu detektieren, die potentielle Targets darstellen. Die RNAseq-Auswertung differentiellen Expression ist erfolgt, die Datenanalyse und der Nachweis der physiologischen Relevanz der putativen Targets stehen noch aus. Zusammenfassend wurde in diesem Projekt durch die Aufnahme der globalen RNA- Expression und die Analyse der marS-Expressionsprofile in drei relevanten S. pyogenes-Serotypen die serotypen-übergreifende Rolle von marS untermauert. Durch die Bereitstellung von verbesserten Deletions- und Komplementationskonstrukten wurden darüber hinaus die Voraussetzungen für die detaillierte Analyse des MarS-Regulons geschaffen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
Whole-Genome Sequence of Streptococcus pyogenes Strain 591, Belonging to the Genotype emm 49. Microbiology Resource Announcements, 10(43).
Patenge, Nadja; Rückert, Christian; Bull, Jana; Strey, Kevin; Kalinowski, Joern & Kreikemeyer, Bernd
