Lange nicht-codierende RNAs (lncRNAs) in der Reaktion auf DNA Schäden in Arabidopsis thaliana

• Antragsteller: Professor Dr. Reinhard Kunze
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 420731442

In den letzten Jahren wurde wurde deutlich, dass in eukaryontischen Zellen tausende von langen nicht-codierenden RNAs (lncRNAs) exprimiert werden und etwa ein Drittel davon Transposons sind oder Transposonsequenzen enthalten. Es wird angenommen, dass die meisten lncRNAs an Genregulation und Transposon-Silencing beteiligt sind, aber bislang sind nur wenige lncRNAs funktionell charakterisiert worden, die meisten davon in Säugerzellen. In einem Screen auf Transposons in Arabidopsis thaliana, die in Folge von durch Röntgenstrahlung verursachten DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) transkriptionell reaktiviert werden, haben wir ~80 neuartige hoch- oder herabregulierte lncRNAs entdeckt. Die Regulation fast aller dieser lncRNAs ist abhängig von der Proteinkinase ATM, die der zentrale Regulator der die DNA Reparaturmaschinerie aktivierenden Signalkaskade ist. Wir haben mit der funktionellen Analyse der neuartigen lncRNA XlincR begonnen, die spezifisch nach genotoxischer Behandlung hochreguliert wird. Wir fanden heraus, dass in einer xlincr T-DNA Mutante das DNA Reparatur-assoziierte DNA Ligase IV (LIG4) Gen hochreguliert ist. Dies führt zu der Vermutung, dass XlincR - und wahrscheinlich auch weitere nach DNA-Schädigung induzierte lncRNAs - am ‚DNA damage response‘ (DDR) beteiligt sind. (1) Wir werden untersuchen, ob die durch Röntgenstrahlung induzierten lncRNAs auch durch andersartige DNA Schädigungen induziert werden. Für 14 der am stärksten induzierten lncRNAs, von denen die Hälfte Transposons enthalten, sind T-DNA Insertionslinien verfügbar, deren Sensitivität auf DNA Schädigung und phänotypische Entwicklung untersucht wird. (2) Um die Rolle von XlincR im DDR aufzuklären, wird die Gewebe- und Entwicklungsspezifität der Transkription nach Behandlung mit verschiedenen Genotoxinen untersucht. Die XlincR Position im regulatorischen Netzwerk des DDR wird durch Expressionsanalysen in DNA Reparatur-, Replikataions- und Zellzyklus-Mutanten bestimmt. Mittels CRISPR/Cas werden wir eine XlincR-Deletionslinie erzeugen in der die XlincR Sequenz durch eine Zufallssequenz ersetzt wird, und eine Linie in der die zwei XlincR-internen kurzen offenen Leseraster zerstört sind. Zur direkten Visualisierung der DNA Schädigung und der Reparaturkinetik in den verschiedenen Genotypen werden wir den Comet-Assay einsetzen. Die Zielgene von XlincR werden mittels RNA Sequenzierung von Wildtyp und xlincr-Mutanten aufgespürt. Des Weiteren soll untersucht werden, ob in Arabidopsis durch ‚Priming‘ die Widerstandsfähigkeit gegen DNA Schädigung gesteigert wird und ob XlincR darin involviert ist. (3) Wir werden das regulatorische Netzwerk zwischen der Histondemethylase REF6 und XlincR, FLC und FT untersuchen. Wir erwarten, dass dieses Projekt zur Identifizierung von lncRNAs als neuartigen Regulatoren im DDR von A. thaliana führen wird.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortlich: Professor Dr. Thomas Schmülling