Untersuchung der Konformationsdynamik eines ABC Transporters mittels NMR Spektroskopie und PET Fluoreszenzlöschung

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professorin Dr. Ute Hellmich; Privatdozent Dr. Hannes Neuweiler
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Biophysik
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 421388231

ATP binding cassette (ABC) Transporter sind Transmembranproteine, die den aktiven Transport von verschiedensten molekularen Substanzen, darunter kleine organische Moleküle, Zucker, Peptide oder Ionen über die Membranen lebender Zellen bewerkstelligen. ABC Transporter sind medizinisch relevant, da ihr ATP-getriebener Transportmechanismus zu Wirkstoffresistenzen und Mutationen in ABC Transportern zu schweren Krankheiten führen können. Die molekularen Details des Funktionsmechanismus von ABC Transportern sind allerdings nur teilweise verstanden. Die Natur und Reihenfolge der Konformationsänderungen, welche durch ATP Bindung und Hydrolyse an den sogenannten Nucleotide binding domains (NBDs) ausgelöst werden und den Transport des Substrats durch die Transmembrandomäne (TMD) vermitteln, sind zurzeit unklar - Pfade allosterischer Kommunikation sind noch kaum erforscht. Im vorliegenden Projekt verknüpfen wir NMR Spektroskopie und Fluoreszenzlöschung durch photoinduziertem Elektronentransfer (PET), zwei komplementäre Methoden zur Untersuchung von Proteindynamik mit hoher Orts- und Zeitauflösung, um neue Einblicke in den funktionellen Mechanismus des ABC Exporters LmrA aus L. lactis zu gewinnen. Während NMR Spektroskopie atomare Einblicke in Proteinkonformation und -dynamik liefert, untersucht PET Fluoreszenzspektroskopie korrelierte Bewegungen über lokale oder räumlich entfernt liegende Strukturelemente und liefert Zeitkonstanten ortsspezifischer Konformationsänderungen. Wir beginnen unsere Untersuchungen mit der isolierten NBD, wo wir die Auswirkungen von Nukleotidbindung auf die Konformationsdynamik mittels NMR, darunter Relaxation Dispersion und 1H/2H Austauschexperimente, und die Zeitkonstanten der Rekonfiguration ausgewählter Strukturelemente mittels PET Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (PET-FCS) mit Nanosekunden Zeitauflösung aufklären werden. Als nächstes messen wir die Effekte der Interaktionen der TMD auf die Dynamik der NBD im Kontext des Volllängentransporters mit 19F NMR und PET-FCS. Schließlich untersuchen wir die Dimerisierung der NBDs ausgelöst durch Nukleotidbindung und die globalen Bewegungen der TMD Helices, welche Liganden über die Membran transportieren, mit Hilfe von maßgeschneiderten PET Fluoreszenzreportern. Wir erwarten, dass die Ergebnisse dieses Projekts, welches NMR und PET Fluoreszenzspektroskopie als zwei komplementäre spektroskopische Methoden mit hoher Orts- und Zeitauflösung erstmals zusammenbringt, neuartige Informationen über die funktionelle Dynamik von ABC Transportern liefern und somit unser Verständnis der strukturellen und dynamischen Grundlagen von Substrattransport in dieser wichtigen Klasse von Membranproteinen voranbringen werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen