Funktion der Plastidären UMP Kinase, PUMPKIN, in der Verknüpfung des Primären Pyrimidinmetabolismus mit der Stabilisierung Intronhaltiger RNAs

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Jörg Meurer
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie ; Genetik und Genomik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 422702898

Wir untersuchen die Funktionen von PUMPKIN, der einzigen plastidären UMP-Kinase, in der Wahrnehmung und/oder Veränderung des Pyrimidinpools sowie der Steuerung posttranskriptioneller Prozesse. PUMPKIN bildet homomultimere, RNA enthaltene, bis zu Megadalton große RNase-resistente Komplexe. Einige andere Komplexe enthalten möglicherweise keine RNA. Erstaunlicherweise ist PUMPKIN spezifisch mit einigen plastidären Intron-RNAs in vivo assoziiert, wie es plastidäre RIP-Seq-Analysen gezeigt haben. PUMPKIN bindet das Intron von petB direkt, spezifisch und mit hoher Affinität in vitro und deckt dabei wahrscheinlich ansonsten Endonuklease-sensitive Schnittstellen ab. Null-Allele und Knockdowns von PUMPKIN sind photoautotroph lebensfähig, aber deutlich im Wachstum und der plastidären Translation betroffen. RNA-Seq- und RNA-Gel-Blot-Analysen haben gezeigt, dass in pumpkin Mutanten bekannte PEP-Transkripte erniedrigt und NEP-Transkripte erhöht sind. Letzteres könnte bedeuten, dass das UTP-Angebot generell nicht limitierend ist. Wir werden untersuchen, inwieweit die katalytische Aufgabe von PUMPKIN durch eine Funktion in der Wahrnehmung des Uracilnukleotidpools und des RNA-Metabolismus partiell ersetzt wurde. Jedoch ist PUMPKIN in vitro und in vivo enzymatisch aktiv und katalysiert die ATP-abhängige Umsetzung von UMP zu UDP mit Charakteristiken, die typisch für eubakterielle UMP-Kinasen sind. Wir wollen untersuchen, in welchem Umfang und unter welchen Bedingungen das Fehlen der enzymatischen oder der RNA-bindenden Eigenschaft von PUMPKIN zum Phänotyp beitragen. Somit zerlegen wir die individuellen Funktionen von PUMPKIN als UMP-Kinase im Pyrimidinstoffwechsel und als moonlighting RNA-bindendes Protein in posttranskriptionellen Prozessen. Der Einfluss der Ziel-RNAs auf die enzymatische Eigenschaften von PUMPKIN und die Rolle der Nukleotide bei der RNA-Bindung wird ebenso untersucht. Die genetische Komplementation von pumpkin mit einer eubakteriellen UMP-Kinase, die wahrscheinlich nicht befähigt ist, die Ziel-RNAs zu binden, sowie mit rekombinanten Formen von PUMPKIN, die keine oder reduzierte enzymatische Aktivitäten und keine RNA-Bindung aufweisen, sind dienlich, beide Funktionen individuell zu untersuchen. Die Konsequenzen der pumpkin Mutation auf veränderte Uracilnukleotid-abhängige Produktionen von Metaboliten wird quantitativ mittels Massenspektrometrie untersucht. Interaktionspartner und die präzisen Zielsequenzen werden identifiziert sowie der PUMPKIN-Komplex strukturell ausgelöst. Der Beitrag einer weiteren, bisher nicht charakterisierten, eubakteriellen UMP-Kinase (NUMPKIN) zum zellulären Metabolismus wird ebenso untersucht. Wahrscheinlich ist NUMPKIN im Zellkern lokalisiert und hat ebenso eine moonlighting Funktion übernommen. Unsere Daten werden hervorheben, in welchem Umfang die UMP-Kinasen als integrative Sensoren dienen, die die plastidäre und/oder nukleäre Genexpression mit Änderungen des Uracilnukleotid-Pools verknüpfen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen