Bewertung der funktionellen Rolle von Kohäsin und Transkription bei der Genomtopologie während der Embryogenese von Drosophila

• Antragstellerin: Dr. Eileen E. M. Furlong, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Entwicklungsbiologie
• Förderung: Förderung seit 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 422774194

Die 3D-Genomorganisation spielt eine wichtige Rolle, wenn es darum geht, Enhancer über Chromatinschleifen in die Nähe ihrer entsprechenden Promotoren zu bringen. Solche E-P-Schleifen treten innerhalb von Topologie-assoziierten Domänen (TADs) auf, obwohl noch nicht geklärt ist, wie TADs die E-P-Funktion erleichtern. Bei Säugern werden TADs durch Cohesin-vermittelte Schleifenextrusion gebildet. Unklar ist jedoch, wie TADs in anderen Arten gebildet werden und wie die E-P-Schleifenbildung, insbesondere während der Embryogenese, reguliert wird. In Drosophila und in geringerem Maße auch in Mäusen und Menschen weisen viele TAD-Grenzen Merkmale aktiver Transkription wie Promotoren und die Bindung von Transkriptionsmaschinen auf. Darüber hinaus kann das ektopische Einfügen von transkriptionsstarken Transposons eine Grenze de novo bilden, was darauf hinweist, dass die Transkription selbst die Genomtopologie formen kann. Das Unterscheiden von Ursache und Folge von Transkription und Topologie war bisher mit klassischen Loss-of-Function-Mutanten unmöglich aufgrund der frühen embryonalen phänotypischen Letalität, bevor TADs überhaupt etabliert sind. Wir können diese Fragen nun mittels eines neuen optogenetischen Kerndepletionssystems (iLEXY) lösen, das wir entwickelt haben, um Kernproteine innerhalb von Minuten im lebenden Embryo zu verringern. Wir werden iLEXY mit hochauflösender Genomik kombinieren, um die Rolle von Cohesin und der basalen Transkriptionsmaschinerie beim Bilden und Aufrechterhalten von TADs und E-P-Schleifen während der Embryogenese von Drosophila zu bestimmen. Wir werden jeweils drei Komponenten des Cohesin (Mau2, Smc3, WapL) und der basalen Transkriptionsmaschinerie (M1bp, Spt4 und Spt5) gezielt ausschalten. M1bp ist essenziell für die Etablierung des Präinitiationskomplexes bei einer Untergruppe konstitutiv aktiver Gene, die an TAD-Grenzen vorhanden sind. Spt4-Spt5 sind für das Pausieren von Pol II und die anschließende Elongation erforderlich. Indem wir alle drei ins Visier nehmen, können wir unterscheiden zwischen der Rolle des PIK-Aufbaus und der Rolle des Pol-II-Pausierens und der Elongation bei der Bildung von TAD-Grenzen. Embryonen, bei denen jedes dieser sechs Proteine schnell ab- und wieder zugeführt wird, werden für hochauflösende Genomtests mit geringem Input verwendet, um (1) die Chromatinbesetzung von Proteinen, (2) Veränderungen in TADs und E-P-Schleifen und (3) die naszierende Transkription zu quantifizieren und die Auswirkungen auf die Expression Gene zu messen. Dies wird zeigen, ob die Cohesin-vermittelte Schleifenextrusion ein evolutionär konservierter Mechanismus bei der Chromatinfaltung ist oder ob es alternative Mechanismen gibt. Es wird auch den ersten Beweis für die Rolle von Transkriptionspausen in der Embryonalentwicklung liefern und bestehende Ideen dazu validieren. Insgesamt hat unser Antrag das Potenzial, zum ersten Mal die Interdependenz zwischen Genomtopologie und Transkription in vivo zu entschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2202: 3-D-Genomarchitektur in Entwicklung und Krankheit