Designer-Transcription Activator-Effector-Chromatin-Affinitätsreinigung (dTALE-ChAP) - eine neuartige in planta Methode zur Aufklärung der Proteinbesetzung eines jeden Promoters der Wahl

• Antragsteller: Professor Dr. Klaus Harter
• Fachliche Zuordnung: Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 426152216

Die Dynamik des Proteoms und seine posttranslationale Regulation, die mit einem bestimmten Promotor verbunden ist, ist entscheidend für seine Aktivität als Reaktion auf Entwicklungsprozesse und Umwelteinflüsse. In Pflanzen gibt es jedoch noch keine Technik, die die quantitative In-vivo-Bestimmung spezifischer Promotor-assoziierter Proteome ermöglicht. Das Projekt zielt darauf ab, eine solche Technik zu etablieren, die als Designer Transkriptionsaktivator wie Effektor-Chromatin-Affinitätsreinigung (dTALE-ChAP) bezeichnet wird. dTALE-ChAP basiert auf GFP-markierten dTALEs, die nach extern induziertem Transfer in den Kern spezifische DNA-Regionen innerhalb eines Promotors der Wahl erkennen und zur Affinitätsreinigung des nahegelegenen Chromatins verwendet werden. Anschließend werden das Chromatin-assoziierte Proteom und seine posttranslationale Modifikation durch Massenspektrometrie (MS) analysiert.Die Etablierung von dTALE-ChAP umfasst vier Schritte: (1) Identifizierung des Funktionsbereichs des interessierenden Promotors. (2) Design und Klonierung mehrerer spezifischer dTALEs, um den gesamten Promotor abzudecken. (3) Untersuchung der intrazellulären Lokalisation der dTALEs und ihrer Fähigkeit, an ihre Zielstelle im Promotor zu binden. (4) Implementierung des quantitativen dTALE-ChAP nach metabolischer 14N / 15N-Markierung von Arabidopsis-Keimlingen und Analyse des affinitätsgereinigten Proteoms und seiner Modifikation. Zunächst wird das Proteom am Promotor der Flagellin 22 Induced Receptor Like Kinase (pFRK1) -Gens analysiert, da bereits zahlreiche vorläufige Daten vorliegen. Anschließend wird dTALE-ChAP auf den Promotor des Arabidopsis Response Regulator 5-Gens (pARR5) ausgedehnt. Der ARR5-Promotor und seine Regulation durch trans-wirkende Faktoren sind für unsere Untersuchung der Cytokinin-Signalleitung von zentralem Interesse. Aus unseren Studien erwarten wir umfassende mechanistische Einblicke in die Dynamik der Proteinzusammensetzung und deren posttranslationalen Modifikationen an pflanzlichen Promotoren und ein tieferes Wissen über die damit verbundenen funktionalen Implikationen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen