Designer-Transcription Activator-Effector-Chromatin-Affinitätsreinigung (dTALE-ChAP) - eine neuartige in planta Methode zur Aufklärung der Proteinbesetzung eines jeden Promoters der Wahl
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Vorhaben sollte die dTALE-ChAP Methode entwickelt werden. Dabei handelt es sich konzeptionell um eine neuartige in vivo Methode, die es erlauben sollte, das Proteom eines beliebigen Promotors zu analysieren. Bei dieser Methode wurden in transgenen Arabidopsis-Keimlingen GFP-getaggte designer Transcription Activator Like Effectors (dTALEs) eingesetzt, die als spezifisch DNA-bindende Ankerproteine für eine Chromatin Affinity Purification (ChAP) dienten. Die über die dTALEs präzipitierten Chromatin-assozierten Proteine wurden mittels Massenspektrometrie (MS) bestimmt. Ziel war es via dTALE-ChAP „unbiased“ Proteine zu identifizieren, die an den Promotor des Flagellin 22 Induced Receptor Like Kinase 1 (pFRK1) Gens oder des Arabidopsis Response Regulator 5 (pARR5) Gens binden. Die Expression dieser Gene wird innerhalb von 60 Min. durch den jeweiligen Liganden stark erhöht (flg22 bei FRK1; Kinetin bei ARR5) Nach metabolischer 14N/15N-Markierung sollten zudem Proteine und Transkriptionsfaktoren (TFs) quantifiziert werden, die Ligand-abhängig mit pFRK1 oder pARR5 interagieren. Zahlreiche Vorexperimente zur z.B. Expression, induzierbaren nukleären Lokalisation, Präzipitierbarkeit aus nukleären Exktrakten, in vivo Bindung der dTALEs an „ihr“ spezifisches DNA-Element zeigten, dass der dTALE-ChAP Ansatz im Prinzip möglich ist. Die Durchführung von dTALE-ChAPs mit spezifischen dTALEs für pFRK1 und pARR5 in Reaktion auf die Präsenz des Liganden ergab Proteine die den GO Bereichen „Heterochromatin organization“, „Chromatin silencing“ und „Negative regulation of gene expression“ zuordnen sind. Was diese Proteine angeht, gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen pFRK1 und pARR5. TFs, deren Bindung an pFRK1 (z.B. WRKYs) und pARR5 (z.B. B-Typ ARRs) zu erwarten gewesen wären, wurden nicht gefunden. Unsere Ergebnisse lassen die Schlussfolgerungen zu, dass (i) dTALE-ChAP generelle Proteinveränderungen in der Organisation des Heterochromatins in Promotoren quantitativ detektieren kann, (ii) für die Detektion von TFs an Promotoren nicht empfindlich genug zu sein scheint und (iii) wir mit unseren Erntezeitpunkten nach Ligandapplikation wohl zeitlich zu spät waren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Designer Transcription Activator Like Effector – Chromatin Affinity Purification (dTALE-ChAP): a novel in planta method to unravel the protein coverage at a promoter of choice. Inaugural Dissertation, Universität Tübingen.
Stefan M. Fischer
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Designer Transcription Activator Like Effector – Chromatin Affinity Purification (dTALE-ChAP): a novel in planta method to unravel the protein coverage at a promoter of choice. Inaugural Dissertation, Universität Tübingen.
Stefan M. Fischer
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The TALE- ChAP: a novel in planta method to identify proteins that associate with a promoter of choice. Molecular Biology of Plants-Konferenz (MBP2020).
Fischer S. M.; Schiele L.; Morbitzer R.; Lahaye T. & Brand LH, Harter K.
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The TALE-ChAP: a novel in planta method to identify proteins that associate with a promoter of choice. 5th RegioPlantScience Conference, University of Hohenheim.
Fischer S.M.; Schiele L.; Morbitzer R.; Lahaye T.; Brand L.H. & Harter K.
