Mechanistisches Verständnis der Spezifität der Wechselwirkung von Glykosaminoglykanen mit regulatorisch wirkenden Proteinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Projekt sollte die Spezifität der Wechselwirkung zwischen Glykosaminoglykanen (GAG) und regulatorisch wirksamen Proteinen quantitativ untersucht werden. GAGs sind langkettige unverzweigte Zucker, die einen hohen Sulfatierungsgrad und damit eine hohe negative Ladungsdichte aufweisen. Insbesondere ging es um die Frage, inwieweit die Erkennung von GAG durch Proteine über unspezifische Elektrostatik, oder durch ein Muster an spezifischen Interaktionen, wie Salzbrücken und Wasserstoffbrückenbindungen, erfolgt. Dazu wurde zunächst die Wechselwirkung des kleinen Zytokins Interleukin-8 (IL-8) mit einer Reihe von negativ geladenen Peptiden untersucht. In unseren Vorarbeiten hatten wir die Wechselwirkung von verschiedenen GAG mit IL-8 detailliert untersucht und Strukturmodelle dieser Komplexe erstellt. Hier sollte nun geklärt werden, ob Peptide mit einer ähnlichen Ladungsdichte und –Verteilung wie GAG die gleichen Epitope am Protein binden wie GAGs. Dazu wurde eine Bibliothek von Peptiden synthetisiert, die sich in ihrer Ladungsdicht unterschieden. Die Bindung dieser Peptide an IL-8 wurde vor allem mit Verfahren der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie untersucht. Darüber hinaus wurden computerbasierte Dockingstudien sowie Moleküldynamiksimulationen durchgeführt. Es konnten Strukturmodelle der Wechselwirkung der Peptide mit IL-8 erstellt werden. Es zeigte sich, dass die Peptide tatsächlich die gleichen polybasischen Cluster am Protein binden. Jedoch ist die Affinität der Peptide für IL-8 um Größenordnungen geringer, was auf entropische Effekte zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu GAG liegen die ungebundenen Peptide in einer zufälligen und hochdynamischen Struktur vor, bei der Bindung an IL-8 wird der Konformationsraum der Peptide sehr deutlich verringert, was mit hohem Entropieverlust einhergeht. Ebenso untersuchten wir die Wechselwirkung von neuartigen dendritischen GAG mit IL-8, die für potenzielle regenerative Verfahren interessant sind. Im Verlauf des Projektes erschienen Arbeiten, in denen lösliche paramagnetische Sonden verwendet wurden, um die Oberflächenladung von Proteinen zu messen. Da die Wechselwirkung von GAG mit regulatorischen Proteinen seine Oberflächenladung sehr wichtig ist, untersuchten wir, ob die Methodik geeignet ist, um die Bindung von kleinen Molekülen an Proteine so beschrieben werden kann. Es zeigte sich, dass die in der Tat eine Möglichkeit ist, die Wechselwirkung von Proteinen mit verschiedenen Liganden (GAG, Peptide) experimentell zu beschreiben und Computersimulationen bestätigten die experimentellen Ergebnisse. Im zweiten Teil des Projektes soll die Wechselwirkung von Cathepsin B mit GAG mittels beider Verfahren quantitativ untersucht werden. Cathepsin B verfügt über eine positive Oberflächenladung, so dass eine unspezifische Interaktion mit negativ geladenen Molekülen zu erwarten ist. Wir konnten die Expression und Funktion von Catepsin B erfolgreich etablieren, jedoch nahmen die biochemischen Arbeiten sehr viel mehr Zeit in Anspruch als ursprünglich angenommen. In ersten NMR-Studien konnte gezeigt werden, dass durch die GAG-Bindung einige Signale von Catepsin B eine Verschiebung zeigen. Da jedoch keine Zuordnung der NMR-Signale vorlag, konnten wir keine weiteren Strukturuntersuchungen durchführen. Kristallographische Arbeiten lieferten die Struktur des Catepsin B Komplexes mit Heparin mit einer Auflösung von 1,8 Å. Für eine mögliche Fortführung des Projektes müsste Cathepsin B mit Isotopenmarkierung (2H, 13 C, 15 N) hergestellt und mittels Triple-Resonanz-Methoden zugeordnet werden. Alle experimentellen Arbeiten wurden in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt, während die computerbasierten Techniken von unserem Kooperationspartner Dr. Sergey Samsonov in Polen (University of Gdańsk) durchgeführt wurden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"Untersuchungen zur Interaktion von Glykosaminoglykanen mit löslichen regulatorischen Proteinen“ Dr. rer. nat., Fakultät für Lebenswissenschaften, 2023
Christian Schulze
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Ligand binding of interleukin-8: a comparison of glycosaminoglycans and acidic peptides. Physical Chemistry Chemical Physics, 25(36), 24930-24947.
Schulze, Christian; Danielsson, Annemarie; Liwo, Adam; Huster, Daniel; Samsonov, Sergey A. & Penk, Anja
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Detecting Protein‐Ligand Interactions with Nitroxide Based Paramagnetic Cosolutes. Chemistry – A European Journal, 30(18).
Penk, Anja; Danielsson, Annemarie; Gaardløs, Margrethe; Montag, Cindy; Schöler, Andrea; Huster, Daniel; Samsonov, Sergey A. & Künze, Georg
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Dimerization and Crowding in the Binding of Interleukin 8 to Dendritic Glycosaminoglycans as Artificial Proteoglycans. Chemistry – A European Journal, 30(13).
Dürig, Jan‐Niklas; Schulze, Christian; Bosse, Mathias; Penk, Anja; Huster, Daniel; Keller, Sandro & Rademann, Jörg
