Erfassung der strukturellen Organisation des Mycoplasma pneumoniae Proteoms mittels in-Zell Crosslinking-Massenspektrometrie

• Antragsteller: Professor Dr. Juri Rappsilber
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 426290502

Zellen haben eine komplexe innere Organisation, die durch ex vivo Experimente nicht vollständig erfasst werden kann. So wurden beispielsweise Phasenübergänge und "membranlose Organellen" durch Fluoreszenzmikroskopie und Kryoelektronentomographie nachgewiesen. Ein kürzlich erschienenes Papier, an dem wir beteiligt waren, identifizierte "Proteingemeinschaften" als ein potenzielles Niveau der zellulären Organisation über dem der "Kern"-Proteinkomplexe, das oft bei der Reinigung verloren geht (Kastritis, O'Reilly et al. 2017) und ideal in situ untersucht wird. Über diese Organisation höherer Ordnung des Proteoms ist nur sehr wenig bekannt. Unser derzeit umfassendstes Verständnis für die Organisation des Proteoms stammt aus groß angelegten Proteomikstudien, die Proteinkomplexe durch Affinitätsreinigung / Massenspektrometrie oder Co-Fraktionierung identifizierten. Wichtig ist, dass diese Techniken keine topologischen Informationen für die entdeckten Komplexe liefern, so dass die Komplexe für die weitere Strukturanalyse gereinigt werden müssen, was zum Verlust der damit verbundenen Faktoren führen kann. Darüber hinaus werden in der Regel unlösliche oder membranassoziierte Komplexe übersehen. Dies sind Themen, die die Crosslinking Massenspektrometrie (CLMS) angehen kann. In diesem Antrag werden wir die Topologie des Proteoms des pathogenen Organismus Mycoplasma pneumoniae analysieren und herausfinden, inwieweit biologische Prozesse unabhängig von Organellen organisiert sind. Insbesondere werden wir das Expressosom als einen zuvor identifizierten Komplex höherer Ordnung bei M. pneumoniae untersuchen, für den wenig Strukturinformationen bekannt sind. Immunpräzipitationsexperimente haben gezeigt, dass es eine direkte Kopplung von Transkription und Translation bei M. pneumoniae gibt. Es wurden jedoch keine strukturellen Untersuchungen in situ durchgeführt, so dass alle damit verbundenen Faktoren, die für diese Interaktion notwendig sind, unbekannt sind.In-Zell-CLMS kombiniert mit integrativen Strukturmodellierungstechniken wird ein Organisationsmodell des M. pneumoniae Proteoms in situ aufbauen. Das M. pneumoniae Proteom ist hier als Modellorganismus aus zwei Gründen besonders nützlich: Erstens ist es einfach genug, eine umfassende Analyse durch CLMS zu ermöglichen; zweitens wurden viele frühere systemweite Studien durchgeführt und sind somit eine wertvolle Ressource für die Validierung. Unsere Vorarbeiten haben bereits gezeigt, dass wir eine große Anzahl bisher unbekannter Wechselwirkungen erkennen und ausgewählte Wechselwirkungen durch die leistungsstarke Kombination mit der Kryo-Elektronentomographie in der Zelle in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Julia Mahamid am EMBL strukturell weiter validieren können.Die in dieser Studie gewonnenen strukturellen Erkenntnisse auf Systemebene sind zwar generell für Zellbiologen interessant, werden aber auch potenzielle Angriffspunkte für neuartige Therapien gegen diesen Erreger aufzeigen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen