Allele-specific suppression of pathogenic Bestrophin-1 transcripts by targeted CRISPR/Cas9-mediated genome editing
Ophthalmology
Final Report Abstract
Ein gezieltes Entfernen der mutanten BEST1-Genkopie bietet sich als ein sinnvoller Therapieansatz für die BVMD an, wenn gesichert ist, dass eine intakte Genkopie unangetastet bleibt und somit eine Expression des normalen BEST1-Proteins weiterhin, wenn auch in reduzierter Quantität, stattfindet. Die CRISPR/Cas-Technologie lässt solche Eingriffe in das Genom einer Zelle gezielt zu und erlaubt zwischen mutierter und nicht-mutierter DNA-Sequenz mit hinreichender Spezifität und Effizienz zu unterscheiden. Mit den hier durchgeführten Arbeiten im beantragten Projektzeitraum konnten mehrere Zielsetzungen erfolgreich umgesetzt werden. Wir konnten u.a. zeigen, dass (1) vorzeitige Terminationscodons im achten Exon des aus 11 Exonen bestehenden BEST1-Gens NMD- sensitiv sind und somit ein spezifischer Knockout des pathologischen BEST1-Transkrips am mutationstragenden DNA-Strang herbeigeführt werden kann; (2) die BEST1-Kanalfunktion in den genmanipulierten Patienten-RPE Zellen wieder hergestellt werden konnte; (3) sgRNA BEST1-I295del-17nt keine genomweiten OFF-Target Effekte aufweist und (4) durch AAV- vermittelter dualer Übertragung der sgRNA-I295del-17nt/Cas9 Komponenten Allel-spezifische Doppelstrangbrüche am genomischen BEST1-I295del Lokus effizient und spezifisch in iPSC- RPE Zellen induziert werden können. Als Vektor zur Übertragung der erforderlichen CRISPR-Werkzeuge wurde ein modifizierter, „All-in-one“-CRISPR-mini AAV-Vektor mit verkürzten Promotoren getestet. Er sollte als Vehikel für die Sequenzen mutationsspezifischer sgRNAs und SpCas9-Nuklease dienen, die letztlich über virale Transduktion in das Zielgewebe des RPE eingebracht werden könnten. Dieser Vektor zeigte jedoch eine zu geringe Effizienz Doppelstrangbrüche in viral transduzierten iPSC-RPE Zellen zu einzuführen. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern ein proof-of-concept für weitere CRISPR/Cas-gesteuerte Ansätze in der Präzisionsmedizin, speziell um Patienten mit dominant-negativen oder gain-offunction Genmutationen zukünftig eine innovative Behandlungsoption zu bieten. Zur Zeit bleiben jedoch mögliche Applikationswege für die erforderlichen CRISPR/Cas9-Werkzeuge in das betroffene Augengewebe des Patienten offen. Ein Meilenstein in der therapeutischen Anwendung der CRISPR-Technologie wurde Anfang diesen Jahres vom Unternehmen Editas Medicine bekannt gegeben. Ein erstes Kind wurde in der klinischen BRILLIANCE-Studie mit EDIT-101, einem CRISPR-Cas9-basierten Gene-Editing-Kandidaten, behandelt. EDIT-101 richtet sich gegen eine definierte intronische Mutation im CEP290 Gen, die zu einer seltenen Form der erblichen Blindheit (LCA10) führt. Dies ist eine erste in vivo CRISPR-basierte Therapie bei einem pädiatrischen Patienten.
