Struktur und Funktion des Glykoprotein 3 des porzinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom Virus

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Michael Veit
• Fachliche Zuordnung: Tiermedizin
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 427209520

Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus (PRRSV), ein umhülltes negativsträngiges RNA-Virus der Familie Arteriviridae, ist der wichtigste Schaderreger in der Schweineindustrie. Seine Membran enthält zwei Glykoproteinkomplexe, Gp5/M, die zum Virusbudding benötigt werden, und einen heterotrimeren Gp2/3/4-Komplex, von dem vermutet wird, dass er beim Viruseintritt eine Rolle spielt. Informationen zu Gp2/3/4 stammen jedoch hauptsächlich aus Arbeiten mit dem equinen Arteritisvirus, dem Prototyp dieser Virusfamilie. Über die entsprechenden Proteine von PRRSV, die zudem große Aminosäurevariabilität aufweisen, ist sehr wenig bekannt.Wir haben kürzlich grundlegende biochemische Merkmale von Gp3 aus verschiedenen PRRSV-Stämmen untersucht. Eine Fraktion des Proteins wird von infizierten und transfizierten Zellen sekretiert, Gp3 aus PRRSV-1-Stämmen in einem größeren Ausmaß als Gp3 aus PRRSV-2-Stämmen. Ein umgekehrtes Sekretionsverhalten wird beobachtet, wenn die variable C-terminale Domäne ausgetauscht wird. Wir haben auch gezeigt, dass das Protein eine ungewöhnliche Haarnadel-artige Membrantopologie aufweist: Sowohl der N- als auch der C-Terminus sind zum Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) ausgerichtet, die Membranverankerung erfolgt vermutlich über eine amphiphile Helix. Dementsprechend verhindert der Austausch von nur wenigen Aminosäuren in seiner hydrophilen Oberfläche die Sekretion von Gp3 und in seiner hydrophoben Oberfläche erhöht es diese. Diese eher schwache Membranverankerung erklärt, warum eine Teilmenge des Proteins von den Zellen sekretiert wird.Mit diesem Projekt wollen wir die Hypothese testen, dass die hydrophobe Region von Gp3 tatsächlich eine amphiphile Helix ausbildet, wie bioinformatisch vorhergesagt. Wir wollen die Struktur dieser Region in Abwesenheit und Anwesenheit verschiedener künstlicher Membranen mittels CD- und NMR-Spektroskopie bestimmen. Mittels rekombinanter Viren werden wir untersuchen, ob die Virusreplikation in Zellkultur erfordert, dass eine Teilmenge von Gp3 sekretiert wird und ob die Aminosäuresequenz der hydrophoben Region essentiell ist. Sie ist zwischen allen PRRSV-Stämmen hoch konserviert, obwohl amphiphile Helices durch sehr unterschiedliche Peptide gebildet werden können. Als nächstes wollen wir untersuchen, ob lösliches und/oder membrangebundenes Gp3 mit Gp2/4 assoziiert und wie sich der Komplex zusammenfügt. Unter Verwendung von gereinigten Ektodomänen von Gp2/3/4, die sich zu Disulfid-verknüpften Dimeren und Trimeren zusammenfügen, werden wir die Cysteine identifizieren, die die Proteine durch Disulfidbrücken verbinden, und mittels Affinitätschromatographie untersuchen, ob Gp2/3/4 an CD 163 bindet, den essentiellen Rezeptor für den Zelleintritt von PRRS-Viren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen