Bedeutung der räumlichen Verteilung zweier Schlüsselkomponenten des HOG Signalwegs,TcsC und Ypd1, für dessen Funktion im pathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Aspergillus fumigatus ist ein pathogener Pilz, der im Menschen systemische Infektionen mit hoher Mortalität auslösen kann. Neue Therapieoptionen für die Behandlung solcher Aspergillosen werden daher dringend benötigt. Der High Osmolarity Glycerol (HOG) Pathway ist ein in vielen Pilzen vorkommender, zentraler Stress-Signalweg, der durch Fludioxonil und verwandte Wirkstoffe aktiviert werden kann, was für A. fumigatus letale Konsequenzen hat. Aufgrund dieser Eigenschaften sind die genannten Substanzen interessante Kandidaten, um aus ihnen neue, klinisch einsetzbare Wirkstoffe zu entwickeln. Sowohl die HOG-vermittelten, protektiven Stress-Antworten, als auch der Effekt von Fludioxonil werden durch die Sensorkinase TcsC vermittelt. Nach Aktivierung moduliert TcsC die Aktivität des Ypd1 Proteins, das dann die zwei response regulators SskA und Skn7 aktiviert. In einer 2021 in Scientific Reports publizierten Arbeit konnten wir nachweisen, dass Skn7 für den letalen Effekt von Fludioxonil von zentraler Bedeutung ist. In einer zweiten, 2021 in Frontiers in Fungal Biology erschienenen Arbeit konnten wir zeigen, dass ein Verlust des ypd1 Gens letale Konsequenzen hat. Nur wenn sskA und skn7 bereits deletiert sind, kann A. fumigatus den Verlust von ypd1 überleben, ansonsten kommt es zu einer unkontrollierten und tödlichen Aktivierung. Wir untersuchten auch durch Fludioxonil ausgelöste Veränderungen in der Genexpression, wobei drei Stämme verglichen wurden: der Wildtyp und die Deletionsmutanten ΔtcsC und Δskn7. Wie erwartet, zeigte der Fludioxonilempfindliche Wildtyp die stärkste und die Fludioxonil-resistente ΔtcsC Mutante die geringste transkriptionelle Antwort. Diese und parallel erhobene biochemische Daten zeigen, dass Fludioxonil über Skn7 die Zellwand schwächt, was bei einem gleichzeitigen Anstieg des intrazellulären, osmotischen Drucks zum Aufblähen und schließlich zum Platzen der Zellen führt. Untersuchungen zur Lokalisation von TcsC bildeten einen zentralen Teil des Projekts. Zu Beginn war bereits bekannt, dass TcsC sich im Kern befindet, was für eine Sensorkinase ungewöhnlich ist. Wir konnten zeigen, dass die N-terminalen 208 Aminosäuren TcsC in den Kern lotsen und auch für die Antwort auf hyperosmolaren Stress essentiell sind. Dies legte nahe, dass die Kernlokalisation von TcsC auch für seine physiologische Funktion wichtig ist. In der 2021 in Frontiers in Fungal Biology erschienen Arbeit zeigten wir, dass Skn7 nur im Kern und SskA nur im Cytoplasma vorkommt, während das kleine Ypd1 Protein zwischen beiden Kompartimenten pendeln kann. Fludioxonil hat nur geringen Einfluss auf die räumliche Verteilung dieser Proteine, führt aber zu einer Translokation von TcsC in das Cytoplasma. Wir konnten zwei Kernlokalisationsmotive im N-Terminus identifizieren. Ihr Verlust oder der Austausch einer Aminosäure in diesem Bereich verhinderten die Kernlokalisation. Überraschenderweise waren die so entstandenen cytoplasmatischen Varianten von TcsC immer noch in der Lage eine adaptive Antwort auf hyperosmolaren Stress auszulösen. Diese und weitere Ergebnisse wurden kürzlich zur Publikation eingereicht. Die in diesem Projekt gewonnen Daten haben zu einem deutlich verbesserten Verständnis des HOG-Signalwegs in A. fumigatus geführt. Neben Antworten haben sich allerdings auch neue Fragen ergeben, so ist nach wie vor unklar, warum sich TcsC in Abwesenheit von Stress im Kern anreichert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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54. Wissenschaftliche Tagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft, 16.09 – 18.09.2020 (oral presentation online): Novel insights in the antifungal activity of fludioxonil in Aspergillus fumigatus.
Schruefer, S., Böhmer, I., Dichtl, K., Pschibul, A., Kniemeyer, O., Wolf, T., Sae-Ong, T., Panagiotou, G., Brakhage, A. A. & Ebel, F.
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73. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, 12.09. – 14.09.2021 in Berlin und online (oral presentation): The high osmolarity glycerol (HOG) pathway in Aspergillus fumigatus: a key player in stress resistance and a potential drug target.
Schruefer, S., Böhmer, I., Dichtl, K., Kleinemeier, C. & Ebel, F.
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Tagung der DVG-Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“, 14.06. – 16.06.2021 (oral presentation online): The HOG pathway of Aspergillus fumigatus: an important element of stress resistance and a potential drug target.
Schruefer, S., Böhmer, I., Dichtl, K., Pschibul, A., Kniemeyer, O., Wolf, T., Sae-Ong, T., Panagiotou, G., Brakhag, A. A. & Ebel, F.
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The High Osmolarity Glycerol (HOG) Pathway 54. Wissenschaftliche Tagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft, 27.09.2021 (oral presentation online): The High Osmolarity Glycerol (HOG) Pathway - New Insights into a Crucial Fungal Signaling Pathway.
Ebel, F.
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The response regulator Skn7 of Aspergillus fumigatus is essential for the antifungal effect of fludioxonil. Scientific Reports, 11(1).
Schruefer, Sebastian; Böhmer, Isabella; Dichtl, Karl; Spadinger, Anja; Kleinemeier, Christoph & Ebel, Frank
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Ypd1 Is an Essential Protein of the Major Fungal Pathogen Aspergillus fumigatus and a Key Element in the Phosphorelay That Is Targeted by the Antifungal Drug Fludioxonil. Frontiers in Fungal Biology, 2.
Schruefer, Sebastian; Spadinger, Anja; Kleinemeier, Christoph; Schmid, Laura & Ebel, Frank
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56. Wissenschaftliche Tagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft zusammen mit der Österreichischen Gesellschaft für Medizinische Mykologie, 12.09. – 14.09.2022 in Wien (oral presentation): The Ying and Yang of Ypd1, a protein of the HOG pathway that is essential for the viability of Aspergillus fumigatus and the antifungal activity of fludioxonil.
Schruefer, S., Spadinger, A., Kleinemeier, C., Schmid, L. & Ebel F.
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74. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, 05.09.-07.09.2022 in Berlin (oral presentation): Characterization of Ypd1, an essential element of the HOG pathway of Aspergillus fumigatus that is required for the antifungal mechanism of fludioxonil.
Schruefer, S., Spadinger, A., Kleinemeier, C., Schmid, L. & Ebel F.
