Enhancer-basierte Modulation kardialer Fibroblasten

• Antragsteller: Professor Dr. Ralf Gilsbach
• Fachliche Zuordnung: Pharmakologie ; Kardiologie, Angiologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 428316638

Für die Aufrechterhaltung der Herzfunktion sind verschiedene Zelltypen essenziell. Während Kardiomyozyten ausschlaggebend für die Kontraktionskraft sind, bilden Fibroblasten die extrazelluläre Matrix, die das das Herz zusammenhält und stützt. Bei Herzerkrankungen ist die Aktivierung von Fibroblasten von zentraler Bedeutung für die Manifestierung einer pathologischen Fibrose. Die der Aktivierung von Fibroblasten zu Grunde liegenden transkriptionellen Mechanismen sind jedoch unklar. Eine zentrale Rolle für die transkriptionelle Kontrolle spielen Enhancer. Enhancer binden Transkriptionsfaktoren und verstärken die Aktivität von distalen Promotoren. Enhancer sind Zelltyp- und Aktivierungsstatus-abhängig und stellen damit ein vielversprechendes Ziel für zukünftige Interventionen dar.Das Ziel dieses Projekts ist es, Schlüssel-Enhancer für die Aktivierung von Fibroblasten mit epigenetischen Methoden zu identifizieren und mittels CRISPR-Interferenz zu modulieren. Um dieses Ziel zu erreichen, planen wir drei Projektteile.Im Projektteil 1 werden wir Enhancer von ruhenden und aktivierten Fibroblasten mit epigenetischen Methoden (ChIP-seq) annotieren. Wir werden ferner Chromatin-Interaktionsanalysen (Hi-ChIP) durchführen, um die Zielgene der Enhancer aufzuklären. Als tierexperimentelle Krankheitsmodelle werden wir ein Hypertrophiemodell (TAC) und ein pharmakologisches Modell, das eine humorale Aktivierung nachbildet, anwenden. Dieser Projektteil wird für die Aktivierung von Fibroblasten entscheidende Enhancer und ihre Zielgene identifizieren.Im Projektteil 2 werden wir die funktionelle Relevanz von Enhancern in Fibroblasten entschlüsseln. Hierzu werden wir die Aktivität, der im Projektteil 1 identifizierten Enhancer, mittels CRISPR-interferenz (CRISPRi) senken. CRISPRi nutzt eine sgRNA-abhängige und Nuklease-defiziente Cas9, die an eine Repressordomäne fusioniert ist (CRISPRi). Anwenden werden wir einen 2-stufigen CRISPRi-Screen. Die erste Stufe wird Enhancer-spezifische sgRNAs identifizieren, die mit der Fibroblastenaktivierung interferieren. In der 2. Stufe werden wir CRISPRi-Experimente mit Einzelzell-RNA-Sequenzierungen kombinieren, um den Effekt von individuellen und kombinierten sgRNAs auf Genexpressionsprogramme während der Aktivierung von Fibroblasten zu untersuchen. Dieser Projektteil wird CRISPRi-basierte Methoden zur Beeinflussung der Aktivierung von Fibroblasten identifizieren.Im Projektteil 3 werden wir die sgRNAs validieren und hinsichtlich ihrer Spezifität optimieren. Ferner werden ihre Effektivität in vitro und in vivo untersuchen.Die Hypothese dieser Arbeit ist die Aktivität von Fibroblasten mittels einer funktionell genetischen Beeinflussung von Enhancer zu kontrollieren. Dieses Projekt wird wichtige Grundlagen für die funktionelle genetische Therapie der kardialen Fibrose legen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen