Die Rolle der DNA-Protein-Crosslink Reparatur bei der meiotischen Rekombination, der T-DNA Integration und dem Gene Editing

• Antragsteller: Professor Dr. Holger Puchta
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 428712496

Obwohl DNA-Protein Crosslinks (DPC) eine große Bedrohung für die Genomstabilität darstellen, wurden die westlichen Mechanismen der DPC Reparatur erst in den letzten Jahren bei Hefe und Säugern entdeckt und aufgeklärt. Vor kurzem konnten wir als Erste die entsprechenden Reparaturwege bei Pflanzen charakterisieren. So konnten wir zeigen, dass ein Homolog der universellen Protease SPRTN/WSS1 (WSS1A) von entscheidender Bedeutung für die DPC Reparatur bei Arabidopsis ist. Zwei weitere Reparaturwege werden durch die Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 1 (TDP1) und die DNA Endonuklease MUS81 definiert. Zu unserer großen Überraschung entdecken wir bei diesen Analysen, dass WSS1A bei zwei genetischen Phänomenen eine Rolle spielt, mit denen die DPC Reparatur bisher nicht in Verbindung gebracht wurde: der Meiose und der Agrobakterium-Transformation. Tatsächlich spielt bei beiden Vorgängen das Prozessieren von kovalenten DNA-Protein Intermediären eine wichtige Rolle. Bei der wss1a Mutante ist die Fertilität für die weibliche und die männliche Keimbahn eingeschränkt. Zytologisch konnten wir während der Meiose bereits aberrante Intermediäre nachweisen. Mit Hilfe von eingekreuzten meiotischen Mutanten soll nun der Defekt im Ablaufe der Meiose im Detail charakterisiert werden. Weiterhin soll geklärt werden, ob im mutanten Hintergrund sich die Zahl der meiotischen Crossovers verändert. Daneben wollen wir die Rolle der DPC Reparatur bei der T-DNA Transformation im Detail untersuchen. Hier könnte WSSA1 bei der Entfernung der bakteriellen Proteine VirD2 und VirE2 im pflanzlichen Zellkern eine entscheidende Rolle spielen. Auf der einen Seite soll die Effizienz der transienten T-DNA Transformation im Vergleich zur stabilen Integration getestet werden. Zum Zweiten ist die Bestimmung der Sequenzveränderungen an den genomischen T-DNA Integrationsorten das Ziel der Arbeiten. Während Veränderungen beim ersten Vorgang ein Hinweis auf eine Rolle von WSS1A beim Entfernen von stark aber nicht kovalent gebundenen VirE2 Proteins von der T-DNA wären, würden Veränderungen beim Integrationsmuster ein Hinweis auf die Loslösung des kovalent gebundenen VirD2 sein. Das Entfernen von stark aber nicht kovalent gebundener Proteine durch WSS1A könnte auch beim Gene Editing mit CRISPR/Cas eine wichtige Rolle spielen. Es ist bekannt, dass die Endonuklease Cas9 eine sehr starke sequenzspezifische Bindung an die DNA aufweist. Die könnte dazu führen, dass durch die Bindung das Prozessieren von Doppelstrangbrüche und damit auch die Art der der Reparatur durch nicht-homologe End Verknüpfung (NHEJ) oder durch Homologe Rekombination (HR) beeinflusst wird. Deshalb soll unter Verwendung verschiedener Cas9 und Cas12 Nukleasen die DSB Reparatur mittels NHEJ und HR in An- und Abwesenheit von WSS1A verglichen werden. So könnte das Projekt nicht nur neue Einsichten zur meiotischen Rekombination und zur T-DNA Integration ermöglichen, sondern auch einen wichtigen Beitrag zur Verbesserung des Gene Editing leisten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen